304 stainless steel coil tubing kemikal nga sangkap, Ang istruktura sa SPACA6 ectodomain naglangkob sa usa ka gitipigan nga superfamily sa mga protina nga may kalabutan sa gamete fusion.

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Naggamit ka usa ka bersyon sa browser nga adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, gipakita namon ang site nga wala’y mga istilo ug JavaScript.
Ang mga slider nga nagpakita sa tulo ka mga artikulo matag slide.Gamita ang likod ug sunod nga mga buton sa paglihok sa mga slide, o ang slide controller nga mga buton sa katapusan aron sa paglihok sa matag slide.

Ang SPACA6 usa ka sperm-expressed surface protein nga kritikal alang sa gamete fusion atol sa mammalian sexual reproduction.Bisan pa niining sukaranan nga tahas, ang piho nga gimbuhaton sa SPACA6 dili kaayo masabtan.Gipatin-aw namon ang kristal nga istruktura sa extracellular domain sa SPACA6 sa usa ka resolusyon nga 2.2 Å, nga nagpadayag sa usa ka duha ka domain nga protina nga gilangkuban sa usa ka upat nga stranded nga bundle ug Ig-like β-sandwich nga giubanan sa mga quasi-flexible linker.Kini nga estraktura nahisama sa IZUMO1, laing gamete fusion-associated protein, nga naghimo sa SPACA6 ug IZUMO1 nga founding members sa superfamily sa fertilization-associated proteins nga gitawag dinhi isip IST superfamily.Ang IST superfamily kay structurally nga gihubit pinaagi sa iyang twisted four-helix bundle ug usa ka pares sa disulfide-linked CXXC motifs.Usa ka istruktura nga nakabase sa AlphaFold nga pagpangita sa tawhanong proteome nagpaila sa dugang nga mga miyembro sa protina niini nga superfamily;ilabina, daghan niini nga mga protina nalangkit sa gamete fusion.Ang istruktura sa SPACA6 ug ang relasyon niini sa ubang mga miyembro sa superfamily sa IST naghatag sa nawala nga link sa among kahibalo sa mammalian gamete fusion.
Ang matag kinabuhi sa tawo nagsugod sa duha ka separado nga haploid gametes: ang sperm sa amahan ug ang itlog sa inahan.Kini nga sperm mao ang mananaog sa usa ka grabe nga proseso sa pagpili diin milyon-milyon nga mga sperm cell ang moagi sa genital tract sa babaye, nakabuntog sa lainlaing mga babag1 ug gipailalom sa kapasidad, nga nagpauswag sa ilang paglihok ug ang proseso sa mga sangkap sa nawong2,3,4.Bisan kung ang sperm ug oocyte magkita sa usag usa, ang proseso wala pa matapos.Ang oocyte gilibutan sa usa ka layer sa cumulus cells ug usa ka glycoprotein barrier nga gitawag og zona pellucida, diin ang sperm kinahanglang moagi aron makasulod sa oocyte.Ang Spermatozoa naggamit ug kombinasyon sa mga molekula sa adhesion sa nawong ug mga enzyme nga nalangkit sa lamad ug tinago nga mga enzyme aron mabuntog kining kataposang mga babag5.Kini nga mga molekula ug mga enzyme kasagarang gitipigan sa sulod nga lamad ug acrosomal matrix ug mamatikdan kung ang gawas nga lamad sa sperm ma-lysed atol sa acrosomal reaction6.Ang kataposang lakang niining grabeng panaw mao ang sperm-egg fusion nga panghitabo, diin ang duha ka mga selula nagsagol sa ilang mga lamad aron mahimong usa ka diploid nga organismo7.Bisan kung kini nga proseso usa ka groundbreaking sa pagpanganak sa tawo, ang kinahanglan nga mga interaksyon sa molekula dili kaayo masabtan.
Dugang pa sa fertilization sa gametes, ang chemistry sa fusion sa duha ka lipid bilayers kay kaylap nga gitun-an.Sa kinatibuk-an, ang membrane fusion usa ka kusog nga dili paborable nga proseso nga nanginahanglan usa ka catalyst sa protina nga moagi sa usa ka pagbag-o sa istruktura sa istruktura nga nagdala sa duha nga mga lamad nga magkasuod, nga nagbungkag sa ilang pagpadayon ug hinungdan sa fusion8,9.Kini nga mga catalyst sa protina nailhan nga fusogens ug nakit-an sa dili maihap nga mga sistema sa fusion.Gikinahanglan kini alang sa viral nga pagsulod sa mga host cell (pananglitan, gp160 sa HIV-1, spike sa mga coronaviruses, hemagglutinin sa influenza virus)10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 ug gamete-forming fusions sa lower eukaryotes ( HAP2/GCS1 sa mga tanom, protista ug arthropod) 16,17,18,19.Ang mga fusogens alang sa mga gamete sa tawo wala pa madiskobrehi, bisan kung daghang mga protina ang gipakita nga kritikal alang sa pagdugtong sa gamete ug pagsagol.Ang oocyte-expressed CD9, usa ka transmembrane nga protina nga gikinahanglan alang sa pagsagol sa mouse ug human gametes, mao ang unang nadiskobrehan nga 21,22,23.Bisan kung ang tukma nga pag-obra niini nagpabilin nga dili klaro, usa ka papel sa pagdikit, ang istruktura sa adhesion foci sa microvilli sa itlog, ug / o ang husto nga pag-localize sa mga protina sa nawong sa oocyte daw lagmit nga 24,25,26.Ang duha ka labing kasagaran nga mga protina nga kritikal alang sa gamete fusion mao ang sperm protein IZUMO127 ug ang oocyte protein JUNO28, ug ang ilang panag-uban usa ka importante nga lakang sa pag-ila sa gamete ug adhesion sa wala pa ang fusion.Ang laki nga Izumo1 nga knockout nga mga ilaga ug ang babaye nga Juno knockout nga mga ilaga hingpit nga sterile, niini nga mga modelo ang sperm mosulod sa perivitelline nga luna apan ang mga gametes dili mag-fuse.Sa susama, ang panagtagbo naminusan kung ang mga gametes gitambalan nga adunay anti-IZUMO1 o JUNO27,29 nga mga antibodies sa mga eksperimento sa in vitro fertilization sa tawo.
Bag-ohay lang, usa ka bag-ong nadiskobrehan nga grupo sa sperm-expressed proteins phenotypically susama sa IZUMO1 ug JUNO20,30,31,32,33,34,35 nadiskobrehan.Ang sperm acrosomal membrane-associated protein 6 (SPACA6) giila nga kinahanglanon alang sa fertilization sa usa ka dako nga pagtuon sa murine mutagenesis.Ang pagsal-ot sa transgene ngadto sa Spaca6 gene makamugna og nonfusible spermatozoa, bisan tuod kini nga spermatozoa molusot sa perivitelline space 36 .Ang sunod nga knockout nga mga pagtuon sa mga ilaga nagpamatuod nga ang Spaca6 gikinahanglan alang sa gamete fusion 30,32.Ang SPACA6 gipahayag nga halos eksklusibo sa mga testes ug adunay usa ka pattern sa localization nga susama sa IZUMO1, nga mao ang sulod sa intima sa spermatozoa sa wala pa ang acrosomal reaction, ug dayon migrate ngadto sa equatorial region human sa acrosomal reaction 30,32.Ang Spaca6 homologues anaa sa lain-laing mga mammal ug uban pang mga eukaryotes 30 ug ang importansya niini alang sa human gamete fusion napakita pinaagi sa pagpugong sa human fertilization in vitro pinaagi sa pagsukol sa SPACA6 30 .Dili sama sa IZUMO1 ug JUNO, ang mga detalye sa istruktura, interaksyon, ug gimbuhaton sa SPACA6 nagpabilin nga dili klaro.
Aron mas masabtan ang sukaranan nga proseso nga nagpahipi sa pagsagol sa sperm ug mga itlog sa tawo, nga makapahimo kanamo sa pagpahibalo sa umaabot nga mga kalamboan sa pagplano sa pamilya ug pagtambal sa fertility, among gipahigayon ang SPACA6 structural ug biochemical nga mga pagtuon.Ang kristal nga istruktura sa extracellular domain sa SPACA6 nagpakita sa upat ka helical bundle (4HB) ug immunoglobulin-like (Ig-like) domain nga konektado sa quasi-flexible nga mga rehiyon.Sama sa gitagna sa nangaging mga pagtuon, 7,32,37 ang istruktura sa domain sa SPACA6 susama sa IZUMO1 sa tawo, ug ang duha ka protina adunay usa ka talagsaon nga motibo: 4HB nga adunay triangular helical surface ug usa ka parisan sa disulfide-linked CXXC motifs.Gisugyot namon nga ang IZUMO1 ug SPACA6 karon naghubit sa usa ka mas dako, may kalabutan sa istruktura nga superfamily sa mga protina nga may kalabutan sa gamete fusion.Gigamit ang mga bahin nga talagsaon sa superfamily, nagpahigayon kami usa ka kompleto nga pagpangita alang sa AlphaFold structural human proteome, nga nagpaila sa dugang nga mga miyembro niini nga superfamily, lakip ang daghang mga miyembro nga nalambigit sa gamete fusion ug/o fertilization.Mopatim-aw karon nga adunay usa ka komon nga structural fold ug superfamily sa mga protina nga may kalabutan sa gamete fusion, ug ang among istraktura naghatag og usa ka molekular nga mapa niining importante nga aspeto sa mekanismo sa gamete fusion sa tawo.
Ang SPACA6 usa ka single-pass transmembrane protein nga adunay usa ka N-linked glycan ug unom ka putative disulfide bonds (Figures S1a ug S2).Gipahayag namo ang extracellular domain sa SPACA6 sa tawo (residues 27-246) sa Drosophila S2 cells ug giputli ang protina gamit ang nickel affinity, cation exchange, ug size exclusion chromatography (Fig. S1b).Ang giputli nga SPACA6 ectodomain lig-on ug homogenous.Ang pagtuki gamit ang size exclusion chromatography inubanan sa polygonal light scattering (SEC-MALS) nagpadayag sa usa ka peak nga adunay kalkulado nga molekular nga gibug-aton nga 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).Kini nahiuyon sa gidak-on sa SPACA6 monomeric ectodomain, nga nagpakita nga ang oligomerization wala mahitabo sa panahon sa pagputli.Dugang pa, ang circular dichroism (CD) spectroscopy nagpakita sa usa ka sinagol nga α / β nga estraktura nga adunay usa ka punto sa pagkatunaw nga 51.3 °C (Fig. S1d,e).Ang deconvolution sa CD spectra nagpadayag sa 38.6% α-helical ug 15.8% β-stranded nga mga elemento (Figure S1d).
Ang SPACA6 ectodomain gi-kristal gamit ang random matrix seeding38 nga miresulta sa data set nga adunay resolusyon nga 2.2 Å (Table 1 ug Figure S3).Gamit ang kombinasyon sa fragment-based molecular substitution ug SAD phasing data nga adunay bromide exposure para sa structure determination (Table 1 ug Figure S4), ang final refined model naglangkob sa residues 27-246.Sa panahon nga determinado ang istruktura, wala’y magamit nga mga eksperimento o AlphaFold nga istruktura.Ang SPACA6 ectodomain may sukod nga 20 Å × 20 Å × 85 Å, naglangkob sa pito ka helices ug siyam ka β-strands, ug adunay usa ka elongated tertiary fold nga gipalig-on sa unom ka disulfide bonds (Fig. 1a, b).Ang huyang nga densidad sa elektron sa katapusan sa Asn243 nga kadena sa kilid nagpakita nga kini nga nahabilin usa ka N-linked glycosylation.Ang istruktura naglangkob sa duha ka mga dominyo: usa ka N-terminal nga upat ka helix nga bundle (4HB) ug usa ka C-terminal nga Ig-like domain nga adunay usa ka intermediate nga hinge nga rehiyon tali kanila (Fig. 1c).
usa ka Structure sa extracellular domain sa SPACA6.Strip diagram sa extracellular domain sa SPACA6, ang kolor sa kadena gikan sa N ngadto sa C-terminus gikan sa itom nga asul ngadto sa itom nga pula.Ang mga cysteine ​​nga nalangkit sa disulfide bonds gipasiugda sa magenta.b Topology sa extracellular domain sa SPACA6.Gamita ang parehas nga laraw sa kolor sama sa Figure 1a.c SPACA6 extracellular domain.Ang 4HB, bisagra, ug Ig-like nga domain strip nga mga tsart adunay kolor nga orange, berde, ug asul, matag usa.Ang mga lut-od wala gidrowing sa sukod.
Ang 4HB domain sa SPACA6 naglakip sa upat ka mga nag-unang helices (helice 1-4), nga gihan-ay sa porma sa usa ka helical helix (Fig. 2a), alternating tali sa antiparallel ug parallel interaksyon (Fig. 2b).Ang usa ka gamay nga dugang nga single-turn helix (helix 1′) gibutang nga tul-id sa bundle, nga nagporma og triyanggulo nga adunay mga helice 1 ug 2. Kini nga triyanggulo gamay nga deformed sa helical-twisted packing sa medyo dasok nga packing sa helices 3 ug 4 ( Fig. 2a).
4HB N-terminal strip nga tsart.b Top view sa usa ka bundle sa upat ka helice, matag helix gipasiugda sa itom nga asul sa N-terminus ug itom nga pula sa C-terminus.c Top-down spiral wheel diagram para sa 4HB, nga ang matag nahabilin nga gipakita ingon usa ka lingin nga gimarkahan og usa ka letra nga amino acid code;ang upat lang ka amino acid sa ibabaw sa ligid ang giihap.Ang non-polar residues adunay kolor nga yellow, polar uncharged residues kolor berde, positively charged residues kolor asul, ug negatibo nga charged residues kolor pula.d Triangular nga mga nawong sa 4HB domain, uban sa 4HBs sa orange ug bisagra sa berde.Ang duha ka inset nagpakita sa pormag-bato nga disulfide bond.
Ang 4HB gikonsentrar sa usa ka sulod nga hydrophobic core nga gilangkoban nag-una sa aliphatic ug aromatic residues (Fig. 2c).Ang kinauyokan adunay usa ka disulfide bond tali sa Cys41 ug Cys55 nga nagsumpay sa mga helice 1 ug 2 nga magkauban sa usa ka taas nga gipataas nga triyanggulo (Fig. 2d).Duha ka dugang nga disulfide bond ang naporma tali sa CXXC motif sa Helix 1′ ug laing CXXC motif nga makita sa tumoy sa β-hairpin sa hinge region (Fig. 2d).Ang konserbatibo nga arginine residue nga adunay wala mailhi nga function (Arg37) nahimutang sa sulod sa usa ka hollow triangle nga naporma sa mga helice 1′, 1, ug 2. Aliphatic carbon atoms Cβ, Cγ, ug Cδ Arg37 nakig-interact sa hydrophobic core, ug ang mga guanidine nga mga grupo niini cyclically mobalhin. tali sa mga helice 1′ ug 1 pinaagi sa interaksyon tali sa Thr32 backbone ug side chain (Fig. S5a,b).Ang Tyr34 moabot sa lungag nga nagbilin sa duha ka gagmay nga mga lungag diin ang Arg37 mahimong makig-uban sa solvent.
Ang sama sa Ig nga β-sandwich nga mga domain usa ka dako nga superfamily sa mga protina nga adunay komon nga bahin sa duha o labaw pa nga multi-stranded amphipathic β-sheet nga nakig-interact pinaagi sa hydrophobic core 39. Ang C-terminal Ig-like domain sa SPACA6 adunay parehas nga sumbanan ug naglangkob sa duha ka mga sapaw (Fig. S6a).Ang Sheet 1 kay usa ka β-sheet sa upat ka strand (strands D, F, H, ug I) diin ang strands F, H, ug I nagporma og anti-parallel arrangement, ug ang strands I ug D nagkuha og parallel interaction.Ang talaan 2 usa ka gamay nga anti-parallel double-stranded beta sheet (strands E ug G).Ang usa ka internal nga disulfide bond naobserbahan tali sa C-terminus sa E chain ug sa sentro sa H chain (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Kini nga disulfide bond susama sa disulfide bond sa β-sandwich domain sa immunoglobulin40,41.
Ang four-strand β-sheet twists sa tibuok nga gitas-on niini, nga nagporma og asymmetrical edges nga lainlain og porma ug electrostatics.Ang nipis nga ngilit usa ka patag nga hydrophobic nga kalikopan nga nawong nga makita kung itandi sa nahabilin nga dili patas ug electrostatically lainlain nga mga ibabaw sa SPACA6 (Fig. S6b, c).Usa ka halo sa gibutyag nga backbone nga carbonyl/amino nga mga grupo ug polar side chain ang naglibot sa hydrophobic surface (Fig. S6c).Ang mas lapad nga margin gitabonan sa usa ka gitakpan nga helical nga bahin nga nagbabag sa N-terminal nga bahin sa hydrophobic core ug nagporma og tulo ka hydrogen bond nga adunay bukas nga polar nga grupo sa F chain backbone (Fig. S6d).Ang C-terminal nga bahin niini nga ngilit nagporma og dako nga bulsa nga adunay partially exposed hydrophobic core.Ang bulsa gilibutan sa mga positibo nga kaso tungod sa tulo ka set sa doble nga arginine residues (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ug Arg212-Arg214) ug usa ka sentral nga histidine (His220) (Figure S6e).
Ang bisagra nga rehiyon usa ka mubo nga bahin tali sa helical domain ug sa Ig-like domain, nga naglangkob sa usa ka antiparallel three-stranded β-layer (strands A, B ug C), usa ka gamay nga 310 helix, ug pipila ka taas nga random helical nga mga bahin.(Fig. S7).Ang usa ka network sa covalent ug electrostatic contacts sa hinge nga rehiyon makita aron mapalig-on ang oryentasyon tali sa 4HB ug sa Ig-like domain.Ang network mahimong bahinon sa tulo ka bahin.Ang unang bahin naglakip sa duha ka CXXC motifs (27CXXC30 ug 139CXXC142) nga nagporma sa usa ka parisan sa disulfide bonds tali sa β-hairpin sa bisagra ug sa 1′ helix sa 4HB.Ang ikaduhang bahin naglakip sa electrostatic nga mga interaksyon tali sa Ig-like domain ug sa bisagra.Ang Glu132 sa bisagra nagporma og salt bridge nga adunay Arg233 sa Ig-like domain ug Arg135 sa hinge.Ang ikatulong bahin naglakip sa usa ka covalent bond tali sa Ig-like domain ug sa hinge region.Duha ka disulfide bond (Cys124-Cys147 ug Cys128-Cys153) ang nagkonektar sa hinge loop sa usa ka linker nga gipalig-on pinaagi sa electrostatic interaksyon tali sa Gln131 ug sa backbone functional group, nga nagtugot sa access sa unang Ig-like domain.kadena.
Ang istruktura sa SPACA6 ectodomain ug indibidwal nga mga istruktura sa 4HB ug Ig-like nga mga dominyo gigamit sa pagpangita alang sa susama nga istruktura nga mga rekord sa mga database sa protina 42.Gipaila namo ang mga posporo nga adunay taas nga mga marka sa Dali Z, gagmay nga mga standard deviation, ug dagkong mga marka sa LALI (ang ulahi mao ang gidaghanon sa mga residue nga katumbas sa istruktura).Samtang ang unang 10 ka hit gikan sa bug-os nga ectodomain nga pagpangita (Table S1) adunay madawat nga Z-score nga>842, ang pagpangita sa 4HB o Ig-like nga domain lamang nagpakita nga kadaghanan niini nga mga hit katumbas sa β-sandwich lamang.usa ka ubiquitous fold nga makita sa daghang mga protina.Ang tanan nga tulo ka pagpangita sa Dali mibalik lamang sa usa ka resulta: IZUMO1.
Dugay na nga gisugyot nga ang SPACA6 ug IZUMO1 adunay mga pagkaparehas sa istruktura7,32,37.Bisan tuod ang mga ectodomain niining duha ka gamete fusion-associated proteins nag-ambit lamang sa 21% sequence identity (Figure S8a), komplikadong ebidensya, lakip ang usa ka conserved disulfide bond pattern ug usa ka gitagna nga C-terminal Ig-like domain sa SPACA6, nagtugot sa sayo nga mga pagsulay sa pagtukod og usa ka homology model sa A ug SPACA6 mouse gamit ang IZUMO1 isip template37.Ang among istruktura nagpamatuod niini nga mga panagna ug nagpakita sa tinuod nga ang-ang sa pagkaparehas.Sa tinuud, ang mga istruktura sa SPACA6 ug IZUMO137,43,44 adunay parehas nga arkitektura nga duha ka domain (Fig. S8b) nga adunay parehas nga 4HB ug Ig-like β-sandwich domain nga konektado sa usa ka hinge nga rehiyon (Fig. S8c).
Ang IZUMO1 ug SPACA6 4HB adunay kasagaran nga mga kalainan gikan sa naandan nga spiral bundle.Ang kasagaran nga 4HBs, sama sa nakit-an sa SNARE protein complexes nga nalambigit sa endosomal fusion 45,46, adunay parehas nga gilay-on nga mga helice nga nagmintinar sa usa ka kanunay nga curvature sa palibot sa usa ka sentral nga axis 47. Sa kasukwahi, ang helical domain sa IZUMO1 ug SPACA6 gituis, nga adunay variable curvature ug dili patas nga pagputos (Figure S8d).Ang twist, lagmit tungod sa triyanggulo nga naporma sa helices 1′, 1 ug 2, gipabilin sa IZUMO1 ug SPACA6 ug gipalig-on sa samang CXXC motif sa helix 1′.Bisan pa, ang dugang nga disulfide bond nga makita sa SPACA6 (Cys41 ug Cys55 covalently linking helices 1 ug 2 sa ibabaw) nagmugna og mas hait nga apex sa triangle apex, nga naghimo sa SPACA6 nga labaw nga twisted kay sa IZUMO1, nga adunay mas klaro nga cavity triangles.Dugang pa, ang IZUMO1 kulang sa Arg37 nga naobserbahan sa sentro niini nga lungag sa SPACA6.Sa kasukwahi, ang IZUMO1 adunay mas tipikal nga hydrophobic core sa aliphatic ug aromatic residues.
Ang IZUMO1 adunay Ig-like domain nga gilangkoban sa double-stranded ug five-stranded β-sheet43.Ang sobra nga strand sa IZUMO1 mipuli sa coil sa SPACA6, nga nakig-interact sa F strand aron limitahan ang backbone hydrogen bonds sa strand.Ang usa ka makapaikag nga punto sa pagtandi mao ang gitagna nga bayad sa nawong sa mga dominyo nga sama sa Ig sa duha nga mga protina.Ang nawong sa IZUMO1 mas negatibo nga gikarga kaysa sa nawong sa SPACA6.Ang usa ka dugang nga bayad nahimutang duol sa C-terminus nga nag-atubang sa sperm membrane.Sa SPACA6, ang parehas nga mga rehiyon mas neyutral o positibo nga gikargahan (Fig. S8e).Pananglitan, ang hydrophobic nga nawong (nipis nga mga ngilit) ug positibo nga gikarga nga mga gahong (mas lapad nga mga kilid) sa SPACA6 negatibo nga gikargahan sa IZUMO1.
Bisan tuod ang relasyon ug ang sekondaryang istruktura nga mga elemento tali sa IZUMO1 ug SPACA6 maayo nga napreserbar, ang structural alignment sa Ig-like domain nagpakita nga ang duha ka mga dominyo magkalahi sa ilang kinatibuk-ang oryentasyon nga may kalabutan sa usag usa (Fig. S9).Ang spiral bundle sa IZUMO1 gikurba bahin sa β-sandwich, nga nagmugna sa gihulagway kaniadto nga "boomerang" nga porma sa mga 50 ° gikan sa sentro nga axis.Sa kasukwahi, ang helical beam sa SPACA6 gikiling mga 10 ° sa atbang nga direksyon.Ang mga kalainan niini nga mga oryentasyon lagmit tungod sa mga kalainan sa rehiyon sa bisagra.Sa panguna nga lebel sa pagkasunod-sunod, ang IZUMO1 ug SPACA6 adunay gamay nga pagkaparehas sa pagkasunod-sunod sa bisagra, gawas sa mga residu sa cysteine, glycine, ug aspartic acid.Ingon usa ka sangputanan, ang mga bugkos sa hydrogen ug mga network sa electrostatic hingpit nga lahi.Ang β-sheet secondary structure nga mga elemento gipaambit sa IZUMO1 ug SPACA6, bisan kung ang mga kadena sa IZUMO1 mas taas ug ang 310 helix (helix 5) talagsaon sa SPACA6.Kini nga mga kalainan nagresulta sa lainlaing mga oryentasyon sa domain alang sa duha nga parehas nga mga protina.
Gipadayag sa among pagpangita sa Dali nga server nga ang SPACA6 ug IZUMO1 mao ra ang duha nga gitino sa eksperimento nga mga istruktura nga gitipigan sa database sa protina nga adunay kini nga partikular nga 4HB fold (Table S1).Bag-ohay lang, ang DeepMind (Alphabet/Google) nagpalambo sa AlphaFold, usa ka sistema nga nakabase sa neural network nga tukma nga makatagna sa 3D nga mga istruktura sa mga protina gikan sa panguna nga mga han-ay48.Wala madugay human namo masulbad ang estruktura sa SPACA6, ang database sa AlphaFold gibuhian, nga naghatag ug predictive structure nga mga modelo nga naglangkob sa 98.5% sa tanang protina sa human proteome48,49.Gigamit ang among nasulbad nga istruktura sa SPACA6 ingon usa ka modelo sa pagpangita, usa ka pagpangita sa istruktura nga homology alang sa modelo sa AlphaFold human proteome nga nagpaila sa mga kandidato nga adunay posible nga pagkaparehas sa istruktura sa SPACA6 ug IZUMO1.Tungod sa talagsaon nga katukma sa AlphaFold sa pagtagna sa SPACA6 (Fig. S10a) -ilabi na ang 1.1 Å rms ectodomain kon itandi sa atong nasulbad nga istruktura (Fig. S10b) -makasalig kita nga ang giila nga SPACA6 nga mga posporo lagmit nga tukma.
Kaniadto, ang PSI-BLAST nangita alang sa IZUMO1 cluster nga adunay tulo ka laing sperm-associated proteins: IZUMO2, IZUMO3, ug IZUMO450.Gitagna sa AlphaFold nga kini nga mga protina sa pamilya sa IZUMO napilo sa 4HB domain nga adunay parehas nga pattern sa disulfide bond sama sa IZUMO1 (Mga numero 3a ug S11), bisan kung wala sila usa ka domain nga sama sa Ig.Gipanghimatuud nga ang IZUMO2 ug IZUMO3 mga one-sided membrane nga mga protina nga susama sa IZUMO1, samtang ang IZUMO4 daw gitago.Ang mga gimbuhaton sa IZUMO 2, 3, ug 4 nga mga protina sa gamete fusion wala pa matino.Ang IZUMO3 nahibal-an nga adunay papel sa acrosome biogenesis sa panahon sa sperm development51 ug ang IZUMO protein nakit-an nga nagporma usa ka complex50.Ang pagkonserba sa mga protina sa IZUMO sa mga mammal, reptilya, ug amphibian nagsugyot nga ang ilang potensyal nga pag-obra nahiuyon sa uban pang nahibal-an nga mga protina nga may kalabotan sa gamete-fusion, sama sa DCST1 / 2, SOF1, ug FIMP.
Diagram sa arkitektura sa domain sa IST superfamily, nga adunay 4HB, hinge, ug Ig-like nga mga dominyo nga gipasiugda sa orange, berde, ug asul, matag usa.Ang IZUMO4 adunay talagsaon nga rehiyon sa C-terminal nga itom tan-awon.Ang gikumpirma ug putative disulfide bonds gipakita sa solid ug tuldok nga mga linya, matag usa.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-FEMF1), ug DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) gipakita sa parehas nga kolor sa panel A. Ang disulfide bond gipakita sa magenta.Ang TMEM95, IZUMO2 ug IZUMO3 transmembrane helice wala gipakita.
Dili sama sa protina sa IZUMO, ang ubang mga protina sa SPACA (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, ug SPACA9) gituohan nga lahi sa istruktura gikan sa SPACA6 (Fig. S12).Ang SPACA9 lamang ang adunay 4HB, apan wala kini gilauman nga adunay parehas nga parallel-anti-parallel orientation o parehas nga disulfide bond sama sa SPACA6.Ang SPACA1 ra ang adunay parehas nga domain nga sama sa Ig.Gitagna sa AlphaFold nga ang SPACA3, SPACA4 ug SPACA5 adunay hingpit nga lahi nga istruktura kaysa SPACA6.Makapainteres, ang SPACA4 nahibal-an usab nga adunay papel sa fertilization, apan sa mas dako nga gidak-on kay sa SPACA6, sa baylo nagpadali sa interaksyon tali sa sperm ug oocyte zona pellucida52.
Ang among pagpangita sa AlphaFold nakakaplag ug laing tugma alang sa IZUMO1 ug SPACA6 4HB, TMEM95.Ang TMEM95, usa ka sperm-specific transmembrane nga protina, naghimo sa laki nga mga ilaga nga infertile sa dihang giablated 32,33.Ang Spermatozoa nga kulang sa TMEM95 adunay normal nga morphology, motility, ug ang abilidad sa pagsulod sa zona pellucida ug paggapos sa egg membrane, apan dili maka-fuse sa oocyte membrane.Gipakita sa nangaging mga pagtuon nga ang TMEM95 nag-ambit sa pagkaparehas sa istruktura sa IZUMO133.Sa pagkatinuod, ang AlphaFold nga modelo nagpamatuod nga ang TMEM95 usa ka 4HB nga adunay parehas nga parisan sa CXXC motifs sama sa IZUMO1 ug SPACA6 ug ang samang dugang nga disulfide bond tali sa helices 1 ug 2 nga makita sa SPACA6 (Fig. 3a ug S11).Bisan tuod ang TMEM95 kulang sa usa ka Ig-like domain, kini adunay usa ka rehiyon nga adunay disulfide bond pattern susama sa SPACA6 ug IZUMO1 hinge regions (Fig. 3b).Sa panahon sa pagmantala niini nga manuskrito, ang preprint server nagtaho sa istruktura sa TMEM95, nga nagpamatuod sa resulta sa AlphaFold53.Ang TMEM95 susama kaayo sa SPACA6 ug IZUMO1 ug ebolusyonaryong gikonserbar na sa mga amphibian (Fig. 4 ug S13).
Ang pagpangita sa PSI-BLAST migamit sa NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, ug SOF1 nga mga database aron mahibal-an ang posisyon niini nga mga han-ay sa kahoy sa kinabuhi.Ang mga distansya tali sa mga punto sa sanga wala gipakita sa sukod.
Ang talagsaon nga kinatibuk-ang pagkaparehas sa estruktura tali sa SPACA6 ug IZUMO1 nagsugyot nga sila nagtukod og mga miyembro sa usa ka gitipigan nga structural superfamily nga naglakip sa TMEM95 ug IZUMO 2, 3, ug 4 nga mga protina.nailhan nga mga miyembro: IZUMO1, SPACA6 ug TMEM95.Tungod kay pipila lang ka miyembro ang adunay Ig-like domains, ang timaan sa IST superfamily mao ang 4HB domain, nga adunay talagsaon nga mga bahin nga komon sa tanan niini nga mga protina: 1) Coiled 4HB nga adunay mga helice nga gihan-ay sa usa ka anti-parallel/parallel alternation (Fig . 5a), 2) ang bundle adunay triangular nga nawong nga gilangkoban sa duha ka helice sulod sa bundle ug ikatulo nga vertical helix (Fig. key area (Fig. 5c). Ang CXXC motif, nga makita sa thioredoxin-like proteins, nahibal-an nga naglihok. isip redox sensor 54,55,56 , samtang ang motif sa mga sakop sa pamilya sa IST mahimong malambigit sa protein disulfide isomerases sama sa ERp57 sa gamete fusion.
Ang mga membro sa IST superfamily gihubit pinaagi sa tulo ka mga kinaiya nga bahin sa 4HB domain: upat ka helice nga nag-alternate tali sa parallel ug antiparallel orientation, ba-triangular helical bundle nga mga nawong, ug usa ka ca CXXC double motif nga naporma tali sa gagmay nga mga molekula.) N-terminal helixes (orange) ug hinge nga rehiyon β-hairpin (berde).
Tungod sa kaamgiran tali sa SPACA6 ug IZUMO1, ang abilidad sa kanhi sa paggapos sa IZUMO1 o JUNO gisulayan.Ang biolayer interferometry (BLI) kay usa ka kinetic-based binding method nga gigamit na kaniadto sa pag-ihap sa interaksyon tali sa IZUMO1 ug JUNO.Human sa paglumlum sa biotin-label nga sensor nga adunay IZUMO1 isip usa ka paon nga adunay taas nga konsentrasyon sa JUNO analyte, usa ka lig-on nga signal ang nakit-an (Fig. S14a), nga nagpakita sa usa ka pagbag-o nga gipahinabo sa pagbugkos sa gibag-on sa biomaterial nga gilakip sa tip sa sensor.Susama nga mga signal (ie, JUNO inubanan sa sensor ingon usa ka paon batok sa IZUMO1 analyte) (Fig. S14b).Walay signal nga nakit-an sa dihang gigamit ang SPACA6 isip analyte batok sa sensor-bound IZUMO1 o sensor-bound JUNO (Figure S14a,b).Ang pagkawala niini nga signal nagpakita nga ang extracellular domain sa SPACA6 wala makig-uban sa extracellular domain sa IZUMO1 o JUNO.
Tungod kay ang BLI assay gibase sa biotinylation sa libre nga lysine residues sa bait protein, kini nga pagbag-o makapugong sa pagbugkos kung ang lysine residues nalangkit sa interaksyon.Dugang pa, ang oryentasyon sa pagbugkos nga may kalabotan sa sensor makamugna og steric hindrances, mao nga ang conventional pull-down assays gihimo usab sa recombinant SPACA6, IZUMO1 ug JUNO ectodomains.Bisan pa niini, ang SPACA6 wala mag-ulan sa Iyang-tag nga IZUMO1 o Iyang-tag nga JUNO (Fig. S14c, d), nga nagpakita nga walay interaksyon nga nahiuyon sa naobserbahan sa mga eksperimento sa BLI.Ingon usa ka positibo nga kontrol, among gikumpirma ang interaksiyon sa JUNO nga adunay label nga Iyang IZUMO1 (Mga numero S14e ug S15).
Bisan pa sa pagkaparehas sa istruktura tali sa SPACA6 ug IZUMO1, ang kawalay katakus sa SPACA6 sa paggapos sa JUNO dili ikatingala.Ang nawong sa tawo nga IZUMO1 adunay labaw pa sa 20 residues nga nakig-uban sa JUNO, lakip na ang mga residues gikan sa matag usa sa tulo ka mga rehiyon (bisan tuod ang kadaghanan niini nahimutang sa hinge nga rehiyon) (Fig. S14f).Niini nga mga salin, usa ra ang gitipigan sa SPACA6 (Glu70).Samtang daghang mga salin nga kapuli ang nagpabilin sa ilang orihinal nga biochemical nga kabtangan, ang hinungdanon nga nahabilin nga Arg160 sa IZUMO1 gipulihan sa negatibo nga gikargahan nga Asp148 sa SPACA6;Gipakita sa miaging mga pagtuon nga ang mutation sa Arg160Glu sa IZUMO1 halos hingpit nga nagwagtang sa pagbugkos sa JUNO43.Dugang pa, ang kalainan sa orientation sa domain tali sa IZUMO1 ug SPACA6 dako kaayog nadugangan ang surface area sa JUNO-binding site sa katumbas nga rehiyon sa SPACA6 (Fig. S14g).
Bisan pa sa nahibal-an nga panginahanglan alang sa SPACA6 alang sa gamete fusion ug ang pagkaparehas niini sa IZUMO1, ang SPACA6 dili makita nga adunay katumbas nga JUNO binding function.Busa, kami nagtinguha sa paghiusa sa among structural data uban sa ebidensya sa importansya nga gihatag sa evolutionary biology.Ang sequence alignment sa SPACA6 homologues nagpakita sa pagpreserbar sa komon nga estraktura lapas sa mammals.Pananglitan, ang cysteine ​​​​residues anaa bisan sa layo nga mga amphibian (Fig. 6a).Gamit ang ConSurf server, daghang sequence alignment retention data sa 66 sequence ang gimapa sa SPACA6 surface.Kini nga matang sa pag-analisa mahimong magpakita kung unsang mga residu ang gitipigan sa panahon sa ebolusyon sa protina ug mahimong magpakita kung unsang mga rehiyon sa ibabaw ang adunay papel sa pag-obra.
usa ka Sequence alignment sa SPACA6 ectodomains gikan sa 12 ka lain-laing espisye nga giandam gamit ang CLUSTAL OMEGA.Sumala sa pagtuki sa ConSurf, ang labing konserbatibo nga mga posisyon gimarkahan sa asul.Ang mga residu sa cysteine ​​gipasiugda sa pula.Ang mga utlanan sa domain ug mga elemento sa sekondaryang istruktura gipakita sa ibabaw sa paglinya, diin ang mga pana nagpakita sa β-strands ug ang mga balud nagpaila sa mga helice.Ang NCBI Access Identifiers nga naglangkob sa mga han-ay mao ang: tawo (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin monkey (Cebus mimic, XP_017359366), kabayo (Equus caballus o_xp2_02rcus o 3_02_2012_2012_2012_2012_2012_2012_2012_2012_2013_2012_2013_2012_2013_2013_2013_2013_1111111111111111111, 3 XP_032_034) .), karnero (Ovis aries, XP_014955560), elepante (Loxodonta africana, XP_010585293), iro (Canis lupus familyis, XP_025277208), mouse (Mus musculus, NP_001156381), Tascomanian devil (S30156381) ypus, 8) , 61_89 ug Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Ang pag-numero gibase sa han-ay sa tawo.b Surface representation sa SPACA6 structure nga adunay 4HB sa ibabaw ug Ig-like domain sa ubos, mga kolor base sa conservation estimates gikan sa ConSurf server.Ang labing maayo nga napreserbar nga mga bahin anaa sa asul, ang kasarangang gipreserbar nga mga bahin anaa sa puti, ug ang pinakagamay nga napreserbar anaa sa dalag.purpura nga cysteine.Tulo ka mga patch sa ibabaw nga nagpakita sa taas nga lebel sa proteksyon gipakita sa inset nga adunay label nga mga patch 1, 2 ug 3. Usa ka 4HB nga cartoon ang gipakita sa inset sa tuo sa ibabaw (parehas nga laraw sa kolor).
Ang istruktura sa SPACA6 adunay tulo ka gikonserbar nga mga rehiyon sa nawong (Fig. 6b).Ang Patch 1 naglangkob sa 4HB ug sa hinge region ug adunay duha ka conserved CXXC disulfide bridges, usa ka Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 hinge network (Fig. S7), ug tulo ka conserved outer aromatic residues (Phe31, Tyr73, Phe137)).usa ka mas lapad nga rim sa Ig-like domain (Fig. S6e), nga nagrepresentar sa pipila ka positibo nga gikarga nga residues sa sperm surface.Makapainteres, kini nga patch adunay sulud nga antibody epitope nga gipakita kaniadto nga makabalda sa function sa SPACA6 30.Ang Rehiyon 3 nagsangkad sa bisagra ug usa ka kilid sa Ig-like domain;kini nga rehiyon adunay gikonserbar nga mga proline (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ug nag-atubang sa gawas nga polar/charged residues.Katingad-an, kadaghanan sa mga nahabilin sa nawong sa 4HB daghan kaayo nga variable (Fig. 6b), bisan kung ang pilo gitipigan sa tibuuk nga SPACA6 homologue (ingon nga gipakita sa konserbatismo sa hydrophobic bundle core) ug lapas pa sa IST superfamily.
Bisan kung kini ang pinakagamay nga rehiyon sa SPACA6 nga adunay labing gamay nga makit-an nga mga elemento sa sekondaryang istruktura, daghang mga nahabilin nga rehiyon sa bisagra (lakip ang rehiyon 3) ang labi nga gikonserba taliwala sa mga homologue sa SPACA6, nga mahimong magpakita nga ang oryentasyon sa helical bundle ug β-sandwich adunay papel.isip konserbatibo.Bisan pa, bisan pa sa daghang hydrogen bonding ug electrostatic network sa hinge nga rehiyon sa SPACA6 ug IZUMO1, ang ebidensya sa intrinsic flexibility makita sa pag-align sa daghang gitugotan nga mga istruktura sa IZUMO137,43,44.Ang pag-align sa tagsa-tagsa nga mga dominyo nagsapaw og maayo, apan ang orientasyon sa mga dominyo nga may kalabutan sa usag usa nagkalainlain gikan sa 50 ° ngadto sa 70 ° gikan sa sentral nga axis (Fig. S16).Aron masabtan ang conformational dynamics sa SPACA6 sa solusyon, gihimo ang mga eksperimento sa SAXS (Fig. S17a, b).Ab initio pagtukod pag-usab sa SPACA6 ectodomain nahiuyon sa usa ka sungkod kristal nga estraktura (Fig. S18), bisan tuod ang Kratky plot nagpakita sa pipila ka matang sa pagka-flexible (Fig. S17b).Kini nga konpormasyon sukwahi sa IZUMO1, diin ang wala mabugkos nga protina nagbaton ug boomerang nga porma sa lattice ug sa solusyon43.
Aron espesipikong mailhan ang flexible nga rehiyon, ang hydrogen-deuterium exchange mass spectroscopy (H-DXMS) gihimo sa SPACA6 ug itandi sa datos nga nakuha kaniadto sa IZUMO143 (Fig. 7a, b).Ang SPACA6 klaro nga mas flexible kay sa IZUMO1, ingon nga ebidensya sa mas taas nga deuterium exchange sa tibuok nga istraktura human sa 100,000 s nga pagbaylo.Sa duha ka mga istruktura, ang C-terminal nga bahin sa hinge nga rehiyon nagpakita sa usa ka taas nga lebel sa pagbayloay, nga lagmit nagtugot sa limitado nga rotation sa 4HB ug Ig-sama nga mga dominyo nga may kalabutan sa usag usa.Makapainteres, ang C-terminal nga bahin sa bisagra sa SPACA6, nga gilangkuban sa 147CDLPLDCP154 nga nahabilin, usa ka labi nga gikonserba nga rehiyon 3 (Fig. 6b), nga lagmit nagpakita nga ang pagka-flexible sa interdomain usa ka ebolusyonaryong gitipigan nga bahin sa SPACA6.Sumala sa flexibility analysis, ang CD thermal melt data nagpakita nga ang SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) dili kaayo lig-on kay sa IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Fig. S1e ug S19).
usa ka H-DXMS nga mga hulagway sa SPACA6 ug b IZUMO1.Ang porsyento nga pagbaylo sa deuterium gitino sa gipakita nga mga punto sa oras.Ang lebel sa hydrogen-deuterium exchange gipakita pinaagi sa kolor sa gradient scale gikan sa asul (10%) ngadto sa pula (90%).Ang mga itom nga kahon nagrepresentar sa mga lugar nga adunay taas nga pagbinayloay.Ang mga utlanan sa 4HB, bisagra ug Ig-like domain nga naobserbahan sa kristal nga istruktura gipakita sa ibabaw sa nag-unang han-ay.Ang lebel sa pagbayloay sa Deuterium sa 10 s, 1000 s, ug 100,000 s giplano sa usa ka strip chart nga gipatong sa transparent nga molekular nga mga nawong sa SPACA6 ug IZUMO1.Ang mga bahin sa mga istruktura nga adunay lebel sa pagbaylo sa deuterium nga ubos sa 50% adunay kolor nga puti.Ang mga lugar nga labaw sa 50% H-DXMS exchange gikoloran sa gradient scale.
Ang paggamit sa CRISPR/Cas9 ug mouse gene knockout genetic nga mga estratehiya mitultol sa pag-ila sa daghang mga butang nga importante alang sa sperm ug egg binding ug fusion.Gawas sa maayo nga kinaiya nga interaksyon sa IZUMO1-JUNO ug CD9 nga istruktura, kadaghanan sa mga protina nga may kalabutan sa gamete fusion nagpabilin nga structurally ug functionally enigmatic.Ang biophysical ug structural characterization sa SPACA6 maoy laing piraso sa adhesion/fusion molecular puzzle atol sa fertilization.
Ang SPACA6 ug uban pang mga miyembro sa superfamily sa IST makita nga gikonserba pag-ayo sa mga mammal ingon man sa indibidwal nga mga langgam, reptilya, ug amphibian;sa pagkatinuod, gituohan nga gikinahanglan pa ang SPACA6 alang sa fertilization sa zebrafish 59. Kini nga pag-apod-apod susama sa ubang nailhan nga gamete fusion-associated proteins sama sa DCST134, DCST234, FIMP31, ug SOF132, nga nagsugyot nga kini nga mga hinungdan kulang sa HAP2 (usab nailhan nga GCS1) nga mga protina nga responsable sa catalytic nga kalihokan sa daghang mga protista., mga tanom, ug mga arthropod.Fertilized fusion proteins 60, 61. Bisan pa sa lig-on nga pagkaparehas sa estruktura tali sa SPACA6 ug IZUMO1, ang knockout sa mga gene nga nag-encode sa bisan hain niini nga mga protina miresulta sa pagkabaog sa laki nga mga ilaga, nga nagpakita nga ang ilang mga gimbuhaton sa gamete fusion dili doble..Sa mas lapad, walay usa sa nahibal-an nga mga protina sa sperm nga gikinahanglan alang sa adhesion phase sa fusion nga sobra.
Nagpabilin kini nga usa ka bukas nga pangutana kung ang SPACA6 (ug uban pang mga miyembro sa superfamily sa IST) nag-apil sa intergametic junctions, nagporma sa mga intragametic nga network aron mag-recruit sa mga importanteng protina sa mga fusion point, o tingali molihok isip mga idlas nga fusogens.Ang mga pagtuon sa co-immunoprecipitation sa HEK293T nga mga selula nagpadayag sa usa ka interaksyon tali sa tibuok nga gitas-on nga IZUMO1 ug SPACA632.Bisan pa, ang among mga recombinant nga ectodomain wala mag-interact sa vitro, nga nagsugyot nga ang mga interaksyon nga nakita sa Noda et al.pareho nga gitangtang sa pagtukod (timan-i ang cytoplasmic tail sa IZUMO1, nga gipakita nga dili kinahanglan alang sa fertilization62).Sa laing bahin, ang IZUMO1 ug/o SPACA6 mahimong manginahanglan ug espisipikong mga binding environment nga dili nato iprodyus in vitro, sama sa physiologically specific conformation o molekular complexes nga adunay ubang mga protina (nailhan o wala pa nadiskobrehan).Bisan tuod ang IZUMO1 ectodomain gituohan nga nagpataliwala sa attachment sa spermatozoa ngadto sa itlog sa perivitelline space, ang katuyoan sa SPACA6 ectodomain dili klaro.
Ang istruktura sa SPACA6 nagpadayag sa daghang gitipigan nga mga ibabaw nga mahimong nalambigit sa mga interaksyon sa protina-protina.Ang gipreserbar nga bahin sa hinge nga rehiyon nga kasikbit dayon sa CXXC nga motif (gitudlo nga Patch 1 sa ibabaw) adunay daghang nag-atubang sa gawas nga mga aromatic residues nga sagad gilambigit sa hydrophobic ug π-stacking nga mga interaksyon tali sa biomolecules.Ang lapad nga mga kilid sa Ig-like domain (rehiyon 2) nagporma og usa ka positibo nga gikargahan nga groove nga adunay gikonserbar nga Arg ug Iyang mga residues, ug ang mga antibodies batok niini nga rehiyon kaniadto gigamit aron babagan ang gamete fusion 30.Giila sa antibody ang linear epitope 212RIRPAQLTHRGTFS225, nga adunay tulo sa unom ka arginine residues ug gitipigan pag-ayo ang His220.Dili klaro kung ang dysfunction tungod sa pagbabag sa mga piho nga nahabilin o sa tibuuk nga rehiyon.Ang lokasyon niini nga gintang duol sa C-terminus sa β-sandwich nagpakita sa mga interaksyon sa cis sa silingang mga protina sa sperm, apan dili sa mga protina sa oocyte.Dugang pa, ang pagpabilin sa usa ka kaayo nga flexible proline-rich tangle (site 3) sulod sa bisagra mahimong dapit sa usa ka interaksyon sa protina-protein o, lagmit, nagpakita sa pagpabilin sa pagka-flexible tali sa duha ka mga dominyo.Ang gender importante alang sa wala mailhi nga papel sa SPACA6.fusion sa mga gametes.
Ang SPACA6 adunay mga kabtangan sa intercellular adhesion proteins, lakip ang Ig-like β-sandwich.Daghang adhesive proteins (pananglitan, cadherins, integrins, adhesins, ug IZUMO1) adunay usa o daghan pa nga β-sandwich domain nga nagpalapad sa mga protina gikan sa cell membrane ngadto sa ilang mga target sa kinaiyahan63,64,65.Ang Ig-like domain sa SPACA6 naglangkob usab ug motif nga kasagarang makita sa β-sandwich sa adhesion ug cohesion: doublets sa parallel strands sa mga tumoy sa β-sandwich, nailhan nga mechanical clamps66.Gituohan nga kini nga motibo nagdugang sa pagsukol sa mga pwersa sa paggunting, nga hinungdanon alang sa mga protina nga nalambigit sa intercellular nga mga interaksyon.Bisan pa, bisan pa niini nga pagkaparehas sa mga adhesin, sa pagkakaron walay ebidensya nga ang SPACA6 nakig-uban sa mga puti sa itlog.Ang SPACA6 ectodomain dili makagapos sa JUNO, ug ang SPACA6-expressing HEK293T cells, ingon sa gipakita dinhi, halos dili makig-uban sa mga oocytes nga kulang sa zona 32.Kung ang SPACA6 magtukod ug intergametic bonds, kini nga mga interaksyon mahimong magkinahanglan ug post-translational modifications o mapalig-on sa ubang sperm proteins.Sa pagsuporta sa ulahing pangagpas, ang IZUMO1-kulang nga spermatozoa nagbugkos sa mga oocytes, nga nagpakita nga ang mga molekula gawas sa IZUMO1 nalangkit sa gamete adhesion step 27.
Daghang viral, cellular, ug developmental fusion nga mga protina adunay mga kabtangan nga nagtagna sa ilang function isip fusogens.Pananglitan, ang viral fusion glycoproteins (klase I, II ug III) adunay hydrophobic fusion peptide o loop sa tumoy sa protina nga gisal-ot sa host membrane.Ang hydrophilicity nga mapa sa IZUMO143 ug ang istruktura (determinado ug gitagna) sa superfamily sa IST wala nagpakita nga dayag nga hydrophobic fusion peptide.Busa, kung adunay bisan unsang mga protina sa superfamily nga IST nga naglihok ingon mga fusogens, buhaton nila kini sa paagi nga lahi sa ubang nahibal-an nga mga pananglitan.
Sa konklusyon, ang mga gimbuhaton sa mga miyembro sa IST superfamily sa mga protina nga may kalabutan sa gamete fusion nagpabilin nga usa ka misteryosong misteryo.Ang among gihulagway nga molekula nga recombinant sa SPACA6 ug ang nasulbad nga istruktura niini maghatag ug panabut sa mga relasyon tali sa mga gipaambit nga istruktura ug ang ilang papel sa pagdugtong ug pagsagol sa gamete.
Ang pagkasunod-sunod sa DNA nga katumbas sa gitagna nga tawo nga SPACA6 ectodomain (NCBI accession number NP_001303901.1; residues 27-246) gi-codon-optimized alang sa ekspresyon sa Drosophila melanogaster S2 nga mga selula ug gi-synthesize isip usa ka gene fragment nga adunay sequence encoding Kozak (Eurofins Genomics)., ang BiP secretion signal ug ang katugbang nga 5′ ug 3′ nagtapos alang sa ligation-independent cloning niini nga gene ngadto sa pMT expression vector nga gibase sa metallothionein promoter nga giusab alang sa pagpili sa puromycin (pMT-puro).Ang pMT-puro vector nag-encode sa usa ka thrombin cleavage site nga gisundan sa usa ka 10x-His C-terminal tag (Figure S2).
Ang stable nga transfection sa SPACA6 pMT-puro vector ngadto sa D. melanogaster S2 (Gibco) nga mga selula gihimo nga susama sa protocol nga gigamit alang sa IZUMO1 ug JUNO43.Ang mga selula sa S2 natunaw ug mitubo sa medium sa Schneider (Gibco) nga gidugangan sa katapusang konsentrasyon nga 10% (v/v) nga heat-inactivated fetal calf serum (Gibco) ug 1X antimycotic antibiotic (Gibco).Ang sayo nga mga selyula sa agianan (3.0 x 106 nga mga selula) giputos sa indibidwal nga mga atabay sa 6-well plates (Corning).Human sa 24 ka oras nga paglumlum sa 27 ° C, ang mga selula gibalhin sa usa ka sinagol nga 2 mg sa SPACA6 pMT-puro vector ug Effectene transfection reagent (Qiagen) sumala sa protocol sa tiggama.Ang mga nabalhin nga mga selyula gilumlum sulod sa 72 ka oras ug dayon giani sa 6 mg/ml puromycin.Ang mga selula dayon gilain gikan sa kompleto nga Schneider's medium ug gibutang sa serum free Insect-XPRESS medium (Lonza) alang sa dako nga scale nga produksyon sa protina.Usa ka 1 L nga batch sa S2 cell culture gipatubo ngadto sa 8-10 × 106 ml-1 nga mga selula sa usa ka 2 L ventilated flat-bottomed polypropylene Erlenmeyer flask ug dayon gi-sterilize sa katapusang konsentrasyon nga 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) ug sterile nga nasala.naaghat.Ang naaghat nga mga kultura gilumlom sa 27 ° C. sa 120 rpm sulod sa upat ka adlaw.
Ang gikondisyon nga medium nga adunay SPACA6 gilain pinaagi sa centrifugation sa 5660 × g sa 4 ° C nga gisundan sa usa ka Centramate tangential flow filtration system (Pall Corp) nga adunay 10 kDa MWCO membrane.Ibutang ang concentrated medium nga adunay SPACA6 sa usa ka 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen) column.Ang Ni-NTA resin gihugasan sa 10 column volumes (CV) sa buffer A ug dayon 1 CV sa buffer A gidugang aron mahatagan ang katapusang imidazole nga konsentrasyon nga 50 mM.Ang SPACA6 gi-eluted sa 10 ml nga buffer A nga gidugangan sa imidazole ngadto sa katapusang konsentrasyon nga 500 mM.Ang restriction class thrombin (Millipore Sigma) gidugang direkta sa dialysis tubing (MWCO 12-14 kDa) sa 1 unit kada mg SPACA6 kumpara sa 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ug 150 mM NaCl (buffer B) para sa dialysis.) sa 4°C sulod sa 48 ka oras.Ang thrombin-cleaved SPACA6 unya lasaw tulo ka pilo sa pagpakunhod sa asin konsentrasyon ug loaded ngadto sa usa ka 1 ml MonoS 5/50 GL cation exchange column (Cytiva/GE) equilibrated uban sa 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Ang cation exchanger gihugasan sa 3 CV sa 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, unya ang SPACA6 gi-eluted sa usa ka linear gradient nga 0 ngadto sa 500 mM NaCl sa 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 alang sa 25 CV.Human sa ion exchange chromatography, ang SPACA6 gikonsentrar sa 1 ml ug gi-eluted isocratically gikan sa usa ka ENrich SEC650 10 x 300 column (BioRad) equilibrated sa buffer B. Sumala sa chromatogram, pool ug concentrate fractions nga adunay SPACA6.Ang kaputli kontrolado sa Coomassie-stained electrophoresis sa usa ka 16% SDS-polyacrylamide gel.Ang konsentrasyon sa protina gi-quantified pinaagi sa absorbance sa 280 nm gamit ang Beer-Lambert nga balaod ug ang theoretical molar extinction coefficient.
Ang giputli nga SPACA6 gi-dialyze sa tibuok gabii batok sa 10 mM sodium phosphate, pH 7.4 ug 150 mM NaF ug lasaw ngadto sa 0.16 mg/mL sa wala pa ang pagtuki pinaagi sa CD spectroscopy.Ang spectral scanning sa mga CD nga adunay wavelength nga 185 ngadto sa 260 nm nakolekta sa Jasco J-1500 spectropolarimeter gamit ang quartz cuvettes nga adunay 1 mm optical path length (Helma) sa 25°C sa gikusgon nga 50 nm/min.Ang CD spectra gitul-id sa baseline, nag-average sa 10 ka nakuha, ug gi-convert ngadto sa mean residual ellipticity (θMRE) sa degrees cm2/dmol:
diin ang MW mao ang molekular nga gibug-aton sa matag sample sa Da;Ang N mao ang gidaghanon sa mga amino acid;Ang θ mao ang ellipticity sa mildegrees;d katumbas sa gitas-on sa optical path sa cm;konsentrasyon sa protina sa mga yunit.