310 10 * 1mm Stainless steel coiled tubing kemikal nga sangkap, Ang N-terminal nga mga dominyo sa spidroin nagporma og hydrogels base sa amyloid fibrils ug naghatag og plataporma alang sa immobilization sa protina.

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Naggamit ka usa ka bersyon sa browser nga adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, gipakita namon ang site nga wala’y mga istilo ug JavaScript.
Ang mga slider nga nagpakita sa tulo ka mga artikulo matag slide.Gamita ang likod ug sunod nga mga buton sa paglihok sa mga slide, o ang slide controller nga mga buton sa katapusan aron sa paglihok sa matag slide.

Espesipikasyon

310 10*1mm Stainless steel coiled tubing suppliers

Kemikal nga Komposisyon

Mga Kinaiya sa Mekanikal

Ang recombinant nga spider silk proteins (spider silk proteins) adunay daghang potensyal nga aplikasyon sa pagpalambo sa bag-ong biomaterials, apan ang ilang multimodal ug aggregation-prone nga kinaiyahan naghimo kanila nga lisud makuha ug sayon ​​gamiton.Dinhi among gitaho nga ang mga recombinant nga miniature nga mga protina sa spidroin ug, hinungdanon, ang N-terminal domain (NT) mismo paspas nga nagporma sa pagsuporta sa kaugalingon ug transparent nga mga hydrogel sa 37 °C.fusion nga mga protina nga naglangkob sa NT ug berde nga fluorescent nga protina o purine nucleoside phosphorylase nagporma nga hingpit nga magamit nga mga protina sa fusion.Mga hydrogel.Gipakita sa among mga resulta nga ang recombinant nga NT ug fusion nga mga protina naghatag og taas nga mga abot sa ekspresyon ug naghatag sa mga hydrogel nga adunay madanihon nga mga kabtangan sama sa transparency, gelation nga walay crosslinking, ug direkta nga immobilization sa mga aktibong protina sa taas nga densidad.
Ang mga lawalawa adunay ingon ka daghan sa pito ka lainlaing hugpong sa mga glandula nga seda, ang matag usa nagpatunghag usa ka piho nga klase sa seda.Ang tanan nga pito ka mga espisye sa seda gilangkuban sa mga protina sa seda sa lawalawa (spidroins) nga gibana-bana nga 6000 nga nahabilin ang gitas-on ug adunay usa ka dako nga sentral nga pagbalik-balik nga rehiyon nga gilibutan sa spherical N- ug C-terminal domain (NT ug CT)1,2.Ang labing kaylap nga gitun-an nga matang sa seda, ang panguna nga ampula, gihimo sa panguna nga glandula sa ampula.Niini nga glandula, ang usa ka monolayer sa epithelial cells nag-synthesize sa mga protina sa spidroin ug nagtago niini ngadto sa lumen sa gland, diin kini anaa sa usa ka matunaw nga porma (doping) sa hilabihan ka taas nga konsentrasyon (30-50% w/v)3,4.Ang organisasyon ug pagpahiangay sa mga nag-unang ampullar spidroin protina sa gland gilantugian, apan kadaghanan sa mga eksperimento nga ebidensya nagpakita sa presensya sa usa ka kinatibuk-ang helical ug / o random helical conformation ug micellar o lamellar nga mga istruktura5,6,7,8,9,10.Samtang ang nagbalik-balik nga mga dominyo nag-regulate sa mekanikal nga mga kabtangan sa mga lanot sa seda, nga nagporma sa β-sheet nanocrystals ug amorphous nga mga istruktura11,12,13,14,15, ang katapusan nga mga dominyo nag-regulate sa mga lanot sa seda agig tubag sa pagbag-o sa mga kondisyon sa silk gland16,17,18.Pinaagi sa pagkontrolar sa pagporma sa seda, 19. Ang mga terminal domain gikonserbar sa ebolusyon ug ang ilang gimbuhaton mahimong komon sa tanang protina sa spidrin 2,20,21.Atol sa pag-agi sa glandula, ang pH sa spidroin mikunhod gikan sa mga 7.6 ngadto sa <5.716 ug nagdugang uban sa paggunting ug pag-inat nga gipataliwad-an pinaagi sa paglihok pinaagi sa hinay-hinay nga pagkunhod sa duct.Sa solusyon, ang CT usa ka α-helical constitutive parallel dimer17, apan agig tubag sa ubos nga pH ug shear forces, ang CT nagbuklad ug nag-switch sa β-layers16, 17, nga posibleng maka-trigger sa β-layers sa balik-balik nga mga rehiyon sa Convert 16. Ang NT kay monomeric ubos sa Ang mga kondisyon nga nagpakita sa mga kondisyon sa lumen sa glandula ug nagpataliwala sa solubility sa spidroin, apan sa pagkunhod sa pH, ang protonation sa usa ka gidaghanon sa mga carboxylic acid side chain modala ngadto sa dimerization sa NT nga adunay pKa nga gibana-bana nga 6.5, sa ingon nagpalig-on sa NT ug nag-ayo sa spidroin sa dako. gidaghanon.mga network16,18.Sa ingon, ang NT adunay hinungdanon nga papel sa pagporma sa filament, nga nagbag-o gikan sa usa ka monomer sa sapaw ngadto sa usa ka dimer sa fiber23,24,25.Ang NT nagpabilin nga labi ka matunaw ug helical sa ilawom sa tanan nga mga kondisyon nga gitun-an hangtod karon16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, nga nagdasig sa pag-uswag niini ingon usa ka label nga nagpadako sa solubility alang sa paghimo sa mga heterologous nga protina.
Ang recombinant nga mini nga spider silk protein, nga naglangkob sa usa ka NT, usa ka mubo nga repeat region, usa ka CT, ug usa ka His6 tag (His-NT2RepCT) alang sa pagputli, kay matunaw sa tubig nga buffer sama sa lumad nga spider silk protein ug nagsundog sa lumad nga importante nga mga kinaiya sa silk spider. .coverage 25.31.Ang iyang-NT2RepCT mahimong madugmok ngadto sa padayon nga mga lanot gamit ang usa ka biomimetic machine diin ang usa ka pH 8 soluble coating ma-extruded ngadto sa pH 525,32,33,34,35 water bath.Ang bioreactor fermentation sa E. coli nga nagpahayag sa Iyang-NT2RepCT ug misunod nga post-treatment miresulta sa> 14 g/L nga ani human sa pagputli.Ang taas nga ani, taas nga solubility, ug igo nga tubag sa Iyang-NT2RepCT sa acidic nga mga kondisyon ang tanan gipahinungod sa NT23, 25, 34.
Dinhi among gitaho ang paspas nga pagporma sa mga transparent nga hydrogels gikan sa mga recombinant spidron protein, lakip ang NT nga nag-inusara, pinaagi sa paglumlom sa usa ka solusyon sa protina sa 37 °C.Gamit ang thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) ug transmission electron microscopy (TEM), among nakaplagan nga ang NT ug microspider proteins moagi sa structural transformation ngadto sa β-sheets ug amyloid-like fibrils kung maporma ang mga gel.Dugang pa, ang fusion proteins sa NT ug green fluorescent protein (GFP) o purine nucleoside phosphorylase (PNP) nagporma og mga hydrogel nga adunay fully functional fusion fragment.Ang high-throughput nga ekspresyon sa heterologous nga mga host, inubanan sa paspas nga pagporma sa mga hydrogel ubos sa physiological nga kondisyon, nagbukas sa posibilidad sa cost-effective nga produksyon sa mga hydrogel nga adunay engineered nga mga function.
Dili sama sa kadaghanan nga gitaho nga recombinant spidrin proteins36, ang Iyang-NT2RepCT lig-on sa Tris-HCl buffer sa pH 8 ug mahimong makonsentrar hangtod sa 500 mg/mL nga walay ulan25.Busa, nahingangha kami sa pagkakita nga kini nga protina paspas nga naporma nga tin-aw, nagsuporta sa kaugalingon nga mga hydrogel kung gilumlum sa 37 ° C (Fig. 1b-d).Gipakita sa dugang nga mga pagtuon nga ang His-NT2RepCT gelation nahitabo sa usa ka halapad nga mga konsentrasyon sa protina (10-300 mg / mL) ug nga kini nga konsentrasyon inversely correlated sa oras sa gelation (Fig. 1c ug Supplementary Fig. 1).Aron mahibal-an kung unsang mga bahin sa His-NT2RepCT ang nagpataliwala sa pagporma sa hydrogel, gisusi dayon namon ang matag domain nga tagsa-tagsa ug sa lainlaing mga kombinasyon gamit ang usa ka flask inversion assay (Figure 1a, b).Ang tanan nga gisulayan fractions sa recombinant spidroin nag-umol gels (sa usa ka protina konsentrasyon sa 300 mg/mL) sa ubos pa kay sa 1 h, gawas sa precipitated 2Rep (Fig. 1b).Kini nagsugyot nga ang NT ug CT nga nag-inusara, sa kombinasyon, o nakig-uban sa mga pag-usab, mahimong mag-gel sa 37 ° C ug nga ang His6 tag dili makaapekto niini nga proseso sa bisan unsang mahinungdanong gidak-on.Gihatag ang kasagaran nga ideya nga ang NT usa ka labi ka matunaw ug lig-on nga protina, ug nga ang mga nauna nga mga taho sa recombinant spidroin hydrogels nag-ingon nga ang mga epekto sa gelation sa mga pagbag-o sa conformational sa mga balik-balik nga rehiyon ug / o mga CT, ang NT mismo mahimo.Ang pagkadiskobre sa gelation wala damha.Supplementary Table 1) 37, 38, 39. Talagsaon, NT na gelled sulod sa 10 minutos sa usa ka konsentrasyon sa ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Ang mga eksperimento sa inversion sa vial nga adunay lainlaing mga konsentrasyon sa NT nagpakita nga sa> 50 mg / mL ang solusyon sa NT nga mas paspas kay sa Iyang-NT2RepCT sa katugbang nga konsentrasyon (w / v, Figure 1c).
Ang eskematiko nga representasyon sa lainlaing mga konstruksyon sa spidrin gitun-an niini nga trabaho.b Gel oras sa 37 °C alang sa lain-laing mga recombinant spidroin protina (300 mg/mL) verified pinaagi sa inverting sa vial.CT gel dayon nga walay paglumlum (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm scale).c Gel nga oras sa Iyang-NT2RepCT ug NT sa gipakita nga konsentrasyon sa protina sa 37 ° C.d Mga litrato sa His-NT2RepCT ug NT hydrogels nga adunay spider ug letra nga "NT" nga giimprinta sa ilawom, matag usa (parehong 200 mg/mL, scale bar 5 mm).
Ang mga hydrogel nga naporma sa lain-laing mga recombinant spidron protein adunay gamay nga lain-laing mga kolor, ug ang hubo nga mata nga obserbasyon nagpakita sa lain-laing ang-ang sa transparency (Fig. 1b).Ang mga gel sa NT labi ka tin-aw samtang ang ubang mga gel mahimong opaque.Ang iyang-NT2RepCT ug NT gels nga gisalibay ngadto sa cylindrical tubes mahimong makuha gikan sa agup-op nga wala'y sulod (Fig. 1d).
Aron masulayan kung ang natural nga spider silk coatings gel sa ilalum sa mga kondisyon nga karon nakit-an nga hinungdan sa gelation sa mga recombinant spidron protein, ang mga coatings gikolekta gikan sa dako nga ampulla gland sa Swedish bridge spider (Larinioides sclopetarius).Ang mga coating gitipigan sa 20 mM Tris-HCl buffer sa 50 mg / mL (base sa gisukod nga uga nga gibug-aton), apan walay gelation nga naobserbahan sa panahon sa 21 ka adlaw nga paglumlum sa 37 ° C (Supplementary Figure 2a).
Aron ma-ihap kini nga mga gel, ang mga sukod sa rheological mahimong magamit aron tun-an ang proseso sa gelation ug mahibal-an ang kinatibuk-ang mekanikal nga mga kabtangan.Sa partikular, ang pagmonitor sa storage modulus (elasticity) sa taas nga temperatura makahatag og impormasyon sa gelling temperature ingon man sa viscoelastic properties sa coating.Ang mga eksperimento sa pagtaas sa temperatura (gamit ang 1 ° C / min sa 25-45 ° C, base sa nangaging mga pagtuon gamit ang natural nga sutla nga mga solusyon sa stock) 40,41 nagpakita nga ang storage moduli sa Iyang-NT2RepCT ug NT nga mga solusyon misaka sa pagtaas sa temperatura .nadugangan (Fig. 2 ug Supplementary Fig. 3).Ilabi na, ang NT module nagsugod sa pagtubo sa usa ka mas ubos nga temperatura kumpara sa Iyang-NT2RepCT, nga nahiuyon sa mas paspas nga oras sa gel nga naobserbahan sa dihang ang NT direkta nga gilumlom sa Iyang-NT2RepCT sa 37 ° C (Figure 1).Human sa usa ka sunod-sunod nga pagkunhod sa temperatura, ang storage modulus wala mobalik ngadto sa ubos nga mga bili ug nagpabilin sa ibabaw sa pagkawala modulus (tan-awa ang Supplementary Fig. 3), nga nagpakita sa thermally irreversible stable gelation.Human sa gelation, ang katapusang elastic modulus gikan sa 15 ngadto sa 330 kPa alang sa His-NT2RepCT hydrogels sa usa ka konsentrasyon nga 100-500 mg / mL, ug ang katapusan nga elastic modulus alang sa NT hydrogels (100-500 mg / mL) gikan sa 2 ngadto sa 1400 kPa (Fig., 2 ug kompleto nga ramp data) tan-awa ang Supplementary Fig. 3).
a Pagbag-o sa temperatura sa panahon sa pagsukod sa Iyang-NT2RepCT (300 mg/mL) ug b NT (300 mg/mL) uban sa pag-uyog.Ang mga udyong nagpaila sa trend sa temperatura, ug ang mas gaan nga shading sa data sa storage module naghulagway sa pagsulay sa ubos nga torque values ​​alang sa instrumento kay sa gitino sa tiggama, nga maoy hinungdan sa nagkadaghang kasaba.c End-module accumulation sa Iyang-NT2RepCT ug NT human sa taas nga temperatura (100, 300, ug 500 mg/mL).Ang tanan nga mga pagbasa sa module gikuha sa frequency nga 0.1 Hz.
Ingon usa ka potensyal nga pamaagi alang sa pag-imbestiga sa mga pagbag-o sa conformational nga may kalabotan sa gelation, girekord namon ang FTIR spectra sa Iyang-NT2RepCT ug NT sa wala pa ug pagkahuman sa gelation sa 37 ° C (Figure 3a, b).Sama sa gipaabut, ang spectra sa Iyang-NT2RepCT ug NT nga mga solusyon katumbas sa mga protina nga nagpakita sa α-helix / random coil secondary structure, nga adunay usa ka gipahayag nga banda sa 1645 cm-1.Alang sa duha ka hydrogels, ang gelation miresulta sa pagporma sa duha ka bukton sa tunga-tunga sa I band sa mga 1617 cm-1 ug 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), nga nagpakita sa pagkaporma sa antiparallel β-sheet structures.Kini nga mga pagbag-o mahimo usab nga tin-aw nga makita sa tagsa-tagsa nga ikaduha nga derivative ug kalainan sa gelation spectra (Supplementary Fig. 4b).Ang duha ka mga banda sa NT β-layer mas gipahayag kay sa Iyang-NT2RepCT, nga nagpakita nga ang kinatibuk-ang sulod sa β-layer bands sa NT hydrogel mas taas kay sa NT2RepCT hydrogel.
usa ka FTIR absorption spectra sa Iyang-NT2RepCT ug b NT (parehong 500 mg/mL) sa wala pa (solusyon) ug human sa (gel) paglumlum sa 37 ° C.c TEM nga mga hulagway sa gisuspinde nga 50 mg/ml NT2RepCT gels ug d NT.Scale bar 200 nm.e Fiber diametro sa Iyang-NT2RepCT ug NT hydrogels.n = 100 gisukod nga mga fibril, p <0.0001.Ang mga error bar nagpakita sa standard deviation.Ang sentro sa mga error bar mao ang mean.Usa ka unpaired t-test (two-tailed) gigamit alang sa statistical analysis.f ThT fluorescence sa nagkalain-laing recombinant spidron proteins (100 mg/mL) sa 37 °C nga walay pag-uyog.g NT (100 mg/mL) inoculation experiments gikan sa 100 mg/mL NT gel nga adunay 0%, 5%, 10%, ug 20% ​​nga mga liso.
Ang pagtuki sa gel gamit ang transmission electron microscopy (TEM) nagpakita nga ang hydrogel naglangkob sa amyloid-like fibrils (Fig. 3c, 3d).Ang mga fibril nga naporma sa NT gipahaba (5-12 nm ang diyametro) ug walay sanga, samtang ang Iyang-NT2RepCT nga mga fibril mas mubo ang gitas-on ug mas lapad ang diyametro (7-16 nm) (Fig. 3e).Kini nga mga resulta nagtugot kanamo sa pagsunod sa kinetics sa fibrosis gamit ang thioflavin T (ThT) assay.Alang sa tanan nga mga recombinant spidron proteins, ang fluorescent signal misaka sa dihang ang mga sample gilumlum sa 37 ° C (Fig. 3f, Supplementary Fig. 5a).Nahiuyon niini nga pagpangita, ang mikroskopikong pagsusi sa NT ug His-NT2RepCT ubos sa mga kondisyon sa gelling nagpadayag sa usa ka uniporme nga pagtaas sa ThT fluorescence nga walay mamatikdan nga lokal nga akumulasyon sa ThT-positive aggregates (Supplementary Fig. 5b, c).Ang pagporma sa ThT-positive fibrils wala giubanan sa pagtaas sa NT ug His-NTCT turbidity (Supplementary Fig. 5d), nga nagpasabot nga ang usa ka network sa fibrils sa gel mahimong maporma nga walay pagkompromiso sa katin-aw sa gel.Ang pagpugas pinaagi sa pagdugang og gamay nga pre-formed fibrils makapapaspas pag-ayo sa fibril formation sa pipila ka amyloids42,43,44 apan pagdugang og 5%, 10% o 20% (w/w) NT ngadto sa solusyon sa NT hydrocoagulants.seeding effect (Fig. 3g).Tingali kini tungod sa kamatuoran nga ang mga fibril sa hydrogel medyo naayo ug dili magamit ingon mga liso.
Ang wala damha nga pamatasan sa mga recombinant nga protina sa spidroin sa taas nga temperatura nag-aghat sa dugang nga mga pagtuon sa spectroscopy sa nuclear magnetic resonance (NMR) aron mahibal-an ang mga pagbag-o sa conformational nga may kalabotan sa pagporma sa gel.Ang NMR spectra sa Iyang-NT2RepCT nga mga solusyon nga natala sa paglabay sa panahon sa 37 ° C nagpakita nga ang CT partially folded, samtang ang NT ug 2Rep signal nawala (Fig. 4a), nga nagsugyot nga kini nag-una sa NT ug 2Rep nga partially controlled formation sa His- NT2RepCT hydrogel.Ang signal sa CT gipahinay usab sa 20% sa orihinal nga intensity niini, nga nagsugyot nga ang CT kasagaran giayo ug gilakip sa istruktura sa hydrogel.Alang sa usa ka gamay nga bahin sa CT, nga ingon mobile sama sa preincubated sample ug sa ingon naobserbahan sa solusyon nga NMR, ang spectra kulang sa signal alang sa unang 10 structured residues, lagmit tungod sa lisud nga immobilization sa gilakip nga bahin sa Iyang-NT2Rep.Ang NMR spectra sa -state sa hydrogels -NT2RepCT nagpadayag sa nag-una nga presensya sa α-helice ug β-layers ug, sa usa ka gamay nga gidak-on, ang random coil conformation (Fig. 4b).Ang pag-analisa sa pagbalhin sa kemikal sa mga residu sa methionine nga naa ra sa NT nagpakita nga kini nga domain nakabig sa usa ka istruktura nga β-sheet.Ang time-dependent spectra sa NT sa solusyon nagpakita sa usa ka uniporme nga pagkunhod sa signal intensity (Fig. 4c), ug solid-state NMR sa NT hydrogels nagpakita nga kadaghanan sa NT residues nakabig ngadto sa β-sheet structures (Fig. 4d).Ang conformation sa 2Rep dili matino nga gilain tungod sa iyang kalagmitan sa pagtipon.Bisan pa, ang solid state NMR spectra sa NTCT ug His-NT2RepCT hydrogels susama kaayo (Fig. 4b; Supplementary Fig. 6b), nga nagsugyot nga ang 2Rep nakatampo og gamay sa structural nga bahin sa His-NT2RepCT hydrogel.Alang sa CT hydrogels, α-helice, β-sheets, ug random helical secondary structures nakit-an nga naglungtad (Supplementary Fig. 6d).Kini nagsugyot nga ang pipila ka bahin sa CT nagpabilin nga α-helice samtang ang uban nahimong β-sheet.Busa, ang mga resulta sa NMR spectroscopy nagsugyot nga ang NT importante alang sa hydrogel formation ug usab mausab ngadto sa usa ka β-sheet conformation sa fusion sa 2Rep ug CT.Nahiuyon niini, bag-o lang namon nakit-an nga ang amyloid spatial zippers lagmit maporma sa tanan nga lima ka helices sa NT domain, ug ang Waltz algorithm nagtagna sa usa ka amyloidogenic nga rehiyon sa helix 1 (Fig. 4e).
2D spectra sa 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT nga solusyon sa wala pa (asul) ug 19 ka oras human sa paglumlum (pula) sa 37°C.Ang indibidwal nga mga cross peak sa pula nga spectrum ug F24, G136, polyA sa asul nga spectrum gipunting sa usa ka letra nga mga simbolo sa amino acid ug nahabilin nga mga numero.Gipakita sa mga inset ang pagsalig sa intensity sa signal sa oras alang sa pinili nga mga nahabilin gikan sa NT, 2Rep, ug CT nga mga domain.b Solid-state radiofrequency (RFDR) spectra sa Iyang-NT2RepCT hydrogels.Ang mga correlasyon sa mga residu sa Cα / Cβ nga naobserbahan sa spectra sa RFDR gitino pinaagi sa pagtandi sa mga pagbag-o sa kemikal nga peptide sa modelo ug mga kantidad nga nakuha gikan sa estadistika82,83 ug sa ilang mga sekondaryang istruktura.SSB – rotating sideband.c One-dimensional spectra sa 15N-HSQC 10 mg/mL NT nga solusyon sa panahon sa paglumlum sa 37 °C sulod sa 36 ka oras.Ang inset nagpakita sa volumetric intensity kumpara sa oras.d Solid nga estado RFDR spectra sa NT hydrogels.Ang mga correlasyon sa mga residu sa Cα / Cβ ug ang ilang mga sekondaryang istruktura nga naobserbahan sa spectra sa RFDR gipakita.e Base sa NT45.79 fibrillation propensity profile gikan sa Zipper database (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Ang kusog sa Rosetta sa spatial lightning shift window sa hexapeptide gipakita sa kcal/mol.Ang pula nga mga bar nagpasabot sa hexapeptides nga adunay taas nga fibrosis propensity (Rosetta energy ubos sa -23 kcal/mol; ubos sa tuldok nga linya).Ang mga berdeng bar nagpaila sa mga tipik nga adunay mga kusog sa Rosetta sa ibabaw sa threshold ug busa dili kaayo mahimo nga maporma ang mga steric zippers.Ang mga tipik nga adunay proline wala iapil sa pagtuki (walay mga kolum).Ang mga kwadro nagpakita sa mga dapit sa amyloidosis nga gitagna sa Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).Ang han-ay sa amino acid residues sa NT anaa sa ibabaw, ug ang mga matang sa residues nga makita sa β secondary structure (determinado sa solid-state NMR spectroscopy) gipakita sa pula.Ang mga posisyon sa lima ka NT α-helice gitudlo nga (H1-H5)28.
Sa pH <6.5, ang HT modimerize, nga makasugakod sa init-o urea-induced denaturation18.Aron mapatin-aw kung giunsa ang NT dimerization ug kalig-on makaapekto sa gelation, ang mga solusyon nga adunay sulod nga 100 mg/ml NT gikontrol sa pH 8, 7, ug 6 gamit ang vial inversion test.Ang mga sample sa NT nga gilumlum sa pH 8 ug 7 gelled human sa 30 min sa 37 ° C, apan ang pH 8 gel nagpabilin nga tin-aw, samtang ang pH 7 gel nagpakita sa usa ka makita nga precipitate (Fig. 5a).Sa kasukwahi, ang usa ka solusyon nga adunay HT sa pH 6 wala maporma nga gel, ug ang usa ka dako nga precipitate makita pagkahuman sa 20 min sa 37 ° C.Kini nagsugyot nga ang mga dimer mismo ug/o ang ilang mas taas nga kalig-on kon itandi sa mga monomer makapugong sa gelation.Ang pagporma sa usa ka precipitate alang sa NT sa pH 7 ug 6 wala gilauman, tungod kay gitaho nga ang NT matunaw sa 200 mg / ml27, dali nga mag-refold pagkahuman sa denaturation sa kainit, ug usab nagpabilin ang usa ka α-helix sa ubos nga kantidad sa pH 18. Ang usa ka lagmit nga katin-awan alang niini nga mga kalainan mao nga ang nauna nga gitaho nga mga eksperimento gihimo sa temperatura sa kwarto o sa ubos, o sa medyo ubos nga konsentrasyon sa protina16,18,19.
NT vial inversion test (100 mg/mL) sa pH 8, 7, 6 ug 154 mM NaCl (pH 8) human sa paglumlum sa 37°C.b NT CD spectra nga adunay ug walay 154 mM NaF ug 154 mM NaCl, matag usa.Ang molar ellipticity sa 222 nm nakabig ngadto sa usa ka proporsiyon sa natural nga mga pilo.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C ug 60 °C), NTA72R (37 °C), ug His-NT-L6 (37 °C ug 60 °C).d CD spectra sa NT mutant NT*, NTA72R, ug His-NT-L6.Ang molar ellipticity sa 222 nm nakabig ngadto sa usa ka proporsiyon sa natural nga mga pilo.e Inversion test sa NTFlSp, NTMiSp ug pagkunhod sa NTMiSp (100 mg/mL).Scale bar 5 mm.f CD spectra sa NT, NTFlSp, NTMiSp ug pagkunhod sa NTMiSp.Ang molar ellipticity sa 222 nm nakabig ngadto sa usa ka proporsiyon sa natural nga mga pilo.Ang bug-os nga NT spectra sa 25 °C ug 95 °C gipakita sa Supplementary Figure 8.
Ang physiological nga konsentrasyon sa asin nagtino sa electrostatic nga mga interaksyon tali sa NT subunits ug dimerization sa NT nga pagbalhin ngadto sa ubos nga pH18.Among nakita nga ang presensya sa 154 mM NaCl ug NaF sa pagkatinuod nagpugong sa gelation, matag usa (Fig. 5a, b; Supplementary Fig. 2b) ug nga kini nga mga salts nagdugang sa thermal stability sa NT monomers (Fig. 5b, Supplementary Fig. 8) .Gisugyot usab niini nga ang pagpauswag sa kalig-on, imbes nga dimerisasyon, magpugong sa pagporma sa gel.
Aron masusi pa ang papel sa dimerization sa protina ug kalig-on sa gelation, gigamit namo ang duha ka mutant, NT* ug NTA72R, nga nagpabilin usab nga monomeric sa ubos nga pH28.30.Ang NT* usa ka double charge reversal mutant diin ang dayag nga dipolar charge distribution sa monomer gipatag, nga makapugong sa dimerization ug makapataas sa monomer stability.Ang NTA72R usa ka charged dipole, apan ang Arg-substituted Ala nahimutang sa dimer boundary, busa ang mga mutasyon makabalda sa mga interaksyon sa subunit nga gikinahanglan para sa dimerization.Sa paglumlum sa 37 ° C, ang NT * wala magporma og hydrogel, samtang ang NTA72R nagporma og opaque gel sulod sa 15 min (Fig. 5c).Tungod kay ang NT * ug NTA72R dili mahimong dimerize apan lahi sa monomer stability (Fig. 5d), kini nga mga resulta kusganong nagsugyot nga ang taas nga thermodynamic nga kalig-on makapugong sa NT gikan sa gelling.Gisuportahan usab kini sa kamatuoran nga ang HT * nagporma usa ka gel kung kini dili lig-on sa taas nga temperatura (pagkahuman sa 8 min sa 60 ° C; Fig. 5c).Gipakita na kaniadto nga ang taas nga sulod sa methionine sa NT makapatunaw sa natural nga pagpilo niini ug nga unom ka Met to Leu substitutes (gitawag dinhi nga His-NT-L6) kusganong nagpalig-on sa NT46 monomer.Base sa pangagpas nga gikinahanglan ang structural flexibility alang sa NT gel formation, among nakita nga ang His-NT-L6 stable mutant wala mag-gel sa 37 °C (Figure 5c, d).Bisan pa, ang Iyang-NT-L6 nagporma usab usa ka gel sa paglumlum sa 60 ° С sa 60 min (Fig. 5c).
Ang katakus sa NT nga mabag-o ngadto sa β-sheet nga mga istruktura ug maporma ang mga hydrogels makita nga magamit sa pipila apan dili sa tanan nga mga domain sa NT sa spidroin.Ang mga NT gikan sa lain-laing matang sa seda ug espisye sa kaka, Trichonephila clavipes (NTFlSp), nagporma og mga gel bisan pa sa ilang medyo ubos nga methionine content ug taas nga thermal stability (Fig. 5e, f ug Supplementary Table 2).Sa kasukwahi, ang NT gikan sa gamay nga ampullar protein spidroin gikan sa Araneus ventricosus (NTMiSp) nga adunay ubos nga thermal stability ug taas nga methionine content wala magporma og hydrogels (Supplementary Table 2 ug Fig. 5e, f).Ang ulahi mahimong nalangkit sa presensya sa intramolecular disulfide bonds29,47.Sa makanunayon, sa dihang ang disulfide bonds sa NTMiSp gipakunhod, kini nahimong usa ka hydrogel human sa paglumlum sa 37 ° C sulod sa 10 min (Fig. 5e).Sa konklusyon, kinahanglan nga matikdan nga ang pagka-flexible sa istruktura usa ka importante, apan dili lamang, nga sukdanan sa pagporma sa usa ka gel gikan sa NT.Ang laing hinungdan nga mahimong may kalabutan mao ang kalagmitan sa pagporma sa amyloid fibrils, ug ang pagtuki sa zipper database ug ang Waltz algorithm nagpakita sa usa ka correlation tali sa abilidad sa pagporma gels ug sa presensya sa amyloidogenic nga mga rehiyon, ingon man sa gidak-on sa mga rehiyon nga gitagna. aron maporma ang steric zippers.Adunay usa ka correlation (Supplementary Table 2 ug Supplementary Fig. 9).
Ang abilidad sa NT sa pagporma og mga fibrils ug pagporma og mga gel ubos sa paborableng mga kondisyon nagdala kanamo sa hypothesize nga ang NT fusions uban sa ubang mga tipik sa protina mahimo gihapon nga magporma og mga gel nga adunay bug-os nga function sa fusion partners.Aron sulayan kini, gipaila namo ang green fluorescent protein (GFP) ug purine nucleoside phosphorylase (PNP) sa C-terminus sa NT, matag usa.Ang resulta nga mga protina sa fusion gipahayag sa E. coli nga adunay taas kaayo nga katapusan nga abot (150 mg / L ug 256 mg / L shake flask cultures alang sa His-NT-GFP ug His-NT-PNP, matag usa), nga nahiuyon sa gipakita. alang sa ubang mga protina nga gisagol sa NT Ref.30. Ang iyang-NT-GFP (300mg / mL) ug ang Iyang-NT-PNP (100mg / mL) nga mga protina sa fusion nagporma og mga gel human sa 2 ka oras ug 6.5 ka oras sa 37 ° C ug, importante, ang tipik sa GFP nagpabilin nga wala mausab.naobserbahan human sa gelation, uban sa> 70% sa inisyal nga fluorescence intensity nahibilin human sa gelation (Fig. 6a).Aron masukod ang kalihokan sa PNP sa iyang-NT-PNP nga mga solusyon ug mga gel, kinahanglan namon nga lasaw ang fusion nga protina sa NT tungod kay ang enzymatic nga kalihokan sa lunsay nga pagpangandam naa sa gawas sa detection range sa assay sa gelling concentrations.Ang gel nga naporma nga adunay sagol nga adunay 0.01 mg/mL His-NT-PNP ug 100 mg/mL NT nagpabilin sa 65% sa inisyal nga enzymatic nga kalihokan sa preincubated samples (Fig. 6b).Ang gel nagpabilin nga wala sa panahon sa pagsukod (Supplementary Fig. 10).
usa ka Relative fluorescence intensity sa wala pa ug pagkahuman sa gelation sa Iyang-NT-GFP (300 mg/mL) ug inverted vial nga adunay sulod sa His-NT-GFP hydrogel (300 mg/mL) ubos sa makita ug UV nga kahayag.Ang mga punto nagpakita sa indibidwal nga mga pagsukod (n = 3), ang mga error bar nagpakita sa standard deviation.Ang kasagaran nga kantidad gipakita sa sentro sa mga error bar.Ang kalihokan sa PNP nakuha pinaagi sa fluorometric analysis gamit ang mga solusyon ug mga gel nga naglangkob sa NT (100 mg/ml) ug usa ka sagol nga adunay sulod nga 0.01 mg/ml iyang-NT-PNP ug 100 mg/ml New Taiwan dollars.Ang inset nagpakita sa usa ka inverted vial nga adunay sulod nga hydrogel nga adunay His-NT-PNP (5 mm scale bar).
Dinhi, among gitaho ang pagporma sa mga hydrogel gikan sa NT ug uban pang mga recombinant nga protina sa spidroin pinaagi sa paglumlom sa usa ka solusyon sa protina sa 37 ° C (Figure 1).Gipakita namo nga ang gelation nalangkit sa pagbag-o sa α-helice ngadto sa β-layers ug sa pagporma sa amyloid-like fibrils (Fig. 3 ug 4).Kini nga pagpangita makapahingangha tungod kay ang mga NTs mga coiled globular five-helix nga mga bundle nga nailhan tungod sa ilang hilabihan ka taas nga solubility ug taas nga kalig-on sa mga konsentrasyon> 200 mg / mL sa 4 ° C sulod sa pipila ka mga adlaw27.Dugang pa, ang mga NT dali nga nag-refold pagkahuman sa denaturation sa kainit sa ubos nga konsentrasyon sa protina sa µM.Sumala sa among mga resulta, ang pagporma sa fibril nanginahanglan usa ka kombinasyon sa> 10 mg / mL nga konsentrasyon sa protina ug gamay nga pagtaas sa temperatura (Fig. 1).Kini nahiuyon sa ideya nga ang amyloid fibrils mahimong maporma gikan sa globularly folded proteins nga anaa sa partially unfolded state tungod sa thermal fluctuations ubos sa physiological nga kondisyon 48 .Ang mga pananglitan sa mga protina nga moagi niini nga pagkakabig naglakip sa insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin ug lysozyme51,52,53.Bisan tuod ang NT usa ka α-helix sa iyang lumad nga estado, gibana-bana nga 65% sa polypeptide chain kay compatible sa steric zipper formation (Fig. 4e) 45 .Tungod kay ang monomer dinamikong mobile46, mahimo nga ibutyag kini nga mga potensyal nga amyloidogenic nga mga rehiyon sa kasarangan nga taas nga temperatura ug sa taas nga konsentrasyon sa kinatibuk-ang protina mahimong makaabot sa usa ka kritikal nga konsentrasyon alang sa amyloid fibril formation54.Pagkahuman niini nga pangatarungan, nakit-an namon ang negatibo nga correlation tali sa konsentrasyon sa spidroin ug oras sa gelation (Fig. 1c), ug kung ang monomeric NT conformation mapalig-on pinaagi sa mutasyon (NT *, His-NT-L6) o pinaagi sa pagdugang sa asin, makapugong sa formation hydrogels (Fig. 5).
Sa kadaghanan sa mga kaso, ang amyloid fibrils mawala gikan sa solusyon ingon nga usa ka precipitate, apan ubos sa pipila ka mga kondisyon sila mahimong hydrogels55,56,57.Ang hydrogel-forming fibrils kasagaran adunay taas nga aspeto nga ratio ug nagporma nga lig-on nga tulo-ka-dimensional nga mga network pinaagi sa molekular entanglement, 55,58 nga nahiuyon sa among mga resulta.Alang sa pagporma sa hydrogel in vitro, ang mga protina sagad bug-os o partially nabuklad, pananglitan, pinaagi sa pagkaladlad sa mga organikong solvent, taas nga temperatura (70–90°C) ug/o ubos nga pH (1.5–3.0) 59,60,61,62.Ang mga hydrogel sa spidroin nga gihulagway dinhi wala magkinahanglan og grabe nga pagproseso, ni nagkinahanglan sila og mga cross-linking agent aron mapalig-on ang mga hydrogel.
Gikataho kaniadto nga ang spidroin repeats ug QDs, nga makita nga moagi sa β-sheet switching atol sa silk spinning, nagporma og mga hydrogels.Kung itandi sa among mga nahibal-an, ang mga oras sa paglumlum ug / o mga temperatura sa paglumlum labi ka taas o mas taas, matag usa, ug ang sangputanan nga mga hydrogel kanunay nga opaque (Figure 7 ug Supplementary Table 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Dugang pa sa paspas nga mga panahon sa gel, ang NT hydrogels> 300 mg/mL (30%) milabaw sa tanan nga gihulagway nga recombinant spider silk protein hydrogels, ingon man mga natural nga hydrogels sama sa gelatin, alginate (2%), agar (0.5 % ) ug collagen.(0.6%) (Figure 7 ug Supplementary Tables 1 ug 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Ang oras sa gel ug elastic modulus sa mga hydrogel sa kini nga pagtuon gitandi sa ubang mga hydrogel nga nakabase sa spidroin ug pinili nga mga natural nga hydrogel.Gihatag ang mga pakisayran kauban ang usa ka paghulagway sa mga kondisyon sa gelation.APS Ammonium persulfate, temperatura sa lawak.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Ang mga lawalawa morag nakahimog mga paagi sa pagpugong sa spidrin gikan sa pag-gel sa panahon sa pagtipig.Bisan pa sa taas nga konsentrasyon sa protina sa silk gland, ang dako nga pagbalik-balik nga rehiyon nga may kalabutan sa terminal domain nagpasabot nga ang dayag nga konsentrasyon sa NT ug CT sa gland katumbas sa gibana-bana nga 10-20 mg / ml, sa utlanan niini nga pagtuon.gikinahanglan alang sa in vitro obserbahan hydrogel formation.Dugang pa, ang susama nga mga konsentrasyon sa mga asin 16 nagpalig-on sa NT, sama sa mga glandula sa seda (Fig. 5b).Ang NT conformation gitun-an sa E. coli cytosol ug nakaplagan nga mas hugot nga gipilo kay sa dihang gisusi sa vitro, dugang nga nagpakita nga ang asin o uban pang mga hinungdan makapugong sa pagtipon niini sa vivo.Bisan pa, ang katakus sa mga NT sa pagbag-o sa mga fibril sa β-sheet mahimo’g hinungdanon alang sa pagporma sa filament ug kinahanglan nga imbestigahan sa umaabot nga mga pagtuon.
Dugang pa sa nobela nga mga aspeto sa NT-amyloid-like fibril ug hydrogel formation nga naobserbahan niini nga pagtuon, gipakita usab namo nga kini nga panghitabo mahimo nga adunay biotechnological ug biomedical nga mga aplikasyon (Fig. 8).Isip usa ka pruweba sa konsepto, gihiusa namo ang NT sa GFP o PNP ug gipakita nga ang fusion protein nagporma usab og mga hydrogels kung gilumlum sa 37 °C ug nga ang mga tipik sa GFP ug PNP sa kadaghanan nagpabilin sa ilang kalihokan pagkahuman sa gelation (Figure 6).Ang nucleoside phosphorylases importante nga catalysts synthesis sa nucleoside analogues75, nga naghimo sa atong nadiskobrehan nga may kalabutan sa industriya sa biopharmaceutical.Ang konsepto sa pagpahayag sa mga protina sa fusion nga nagporma og mga transparent nga hydrogel sa ilawom sa paborableng mga kondisyon nagtugot sa paghimo sa mga functionalized nga hydrogels nga adunay paborableng mga kabtangan alang sa usa ka halapad nga aplikasyon sama sa enzyme immobilization, kontrolado nga pagpagawas sa droga ug tissue engineering.Dugang pa, ang NT ug NT* maoy episyente nga mga marker sa ekspresyon30, nga nagpasabot nga ang NT ug ang mga variant niini mahimong magamit alang sa high-throughput nga produksiyon sa mga soluble fusion proteins ug sunod-sunod nga pagmugna sa immobilized target proteins sa 3D hydrogels.
Ang NT matunaw, α-helical ug stable sa ubos nga konsentrasyon (µM) ug 37°C.Sa parehas nga temperatura, apan sa pagtaas sa konsentrasyon (> 10 mg / ml), ang NT nagporma og mga gel nga gilangkuban sa mga fibril nga sama sa amyloid.Ang NT fusion proteins nagporma usab og fibrillar gels nga adunay fully functional fusion fragment, nga nagtugot sa nagkalain-laing mga protina nga dili mapalihok sa 3D hydrogels gamit ang NT.Ubos: NT (PDB: 4FBS) ug mga ilustrasyon sa mga fiber network ug kaubang mga istruktura sa protina (gihunahuna ug wala madala sa sukdanan, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Ang mga konstruksyon (tan-awa ang Supplementary Table 4 alang sa usa ka kompleto nga lista lakip ang mga han-ay sa amino acid) gi-clone sa plasmid pT7 ug giusab ngadto sa E. coli BL21 (DE3).Ang E. coli nga adunay sulud nga engineered plasmids gi-inoculate sa Luria nga sabaw nga gidugangan sa kanamycin (70 mg / l) ug gipatubo sa tibuok gabii sa 30 ° C ug 250 rpm.Ang kultura dayon gi-inoculate sa 1/100 sa LB medium nga adunay kanamycin ug gi-culture sa 30 ° C ug 110 rpm hangtod ang OD600 nakaabot sa 0.8.Alang sa mga pagtuon sa NMR, ang bakterya gipatubo sa M9 minimal nga medium nga adunay 2 g sa D-glucose 13C (Aldrich) ug 1 g sa ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) alang sa pag-label sa protina nga adunay isotopes.Ipaubos ang temperatura ngadto sa 20 degrees Celsius ug iduso ang ekspresyon sa protina gamit ang 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (katapusang konsentrasyon).Human sa tibuok gabii nga pagpahayag sa protina, ang mga selula giani sa 7278 × g, 4 ° C sulod sa 20 min.Ang mga cell pellets gisuspinde pag-usab sa 20 mM Tris-HCl, pH 8, ug nagyelo hangtod sa dugang nga paggamit.Ang natunaw nga mga selyula gi-lysed gamit ang usa ka cell disruptor (TS series machines, Constant Systems Limited, England) sa 30 kPa.Dayon ang mga lysate gi-centrifuge sa 25,000 g sulod sa 30 minutos sa 4 ° C.Alang sa NTMiSp, ang pellet gisuspinde pag-usab sa 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ug gi-sonicated sa 2 min (2 s on/off, 65%), unya gi-centrifuged pag-usab sa 25,000 xg, 4° C. sulod 30 min.Ang supernatant gikarga sa usa ka kolum sa Ni-NTA, gihugasan sa 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, ug sa katapusan ang protina gi-eluted sa 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Aron makamugna NT2RepCT ug Ang NTCT, thrombin digestion nagpaila sa site (ThrCleav) tali sa Iyang ug NT.Ang mga site sa cleavage sa thrombin naa usab sa Iyang-NT-ThrCleav-2Rep (naghimo og 2Rep), Iyang-thioredoxin-ThrCleav-NT (naghimo sa NT), Iyang-thioredoxin-ThrCleav-CT (naghimo sa CT), Iyang-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (nagpatunghag NT*), Iyang-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (nagpatunghag NTA72R), Iyang-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (nagpatunghag NTF1Sp), ug sa Iyang-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (nagpatunghag NTMiSp).Ang mga konstruksyon gitunaw sa thrombin (1: 1000) ug gi-dialyze sa tibuok gabii sa 4 ° C. nga adunay 20 mM Tris-HCl, pH 8, gamit ang Spectra / Por dialysis membrane nga adunay molekular nga gibug-aton nga threshold nga 6-8 kDa.Human sa dialysis, ang solusyon gikarga sa usa ka kolum sa Ni-NTA ug ang effluent nga adunay protina nga interes gikolekta.Ang mga konsentrasyon sa protina gitino pinaagi sa pagsukod sa UV absorbance sa 280 nm gamit ang extinction coefficient sa matag protina, gawas sa NTF1Sp, nga migamit sa Bradford assay sumala sa protocol sa tiggama.Ang kaputli gitino pinaagi sa SDS polyacrylamide (4-20%) gel electrophoresis ug Coomassie brilliant blue staining.Ang mga protina gikonsentrar gamit ang centrifuge filters (VivaSpin 20, GE Healthcare) sa 4000 xg nga adunay 10 kDa molecular weight cutoff sa 20 minutos nga mga siklo.
Ibubo ang solusyon sa protina ug i-pipet pag-ayo ang 150 µl sa usa ka 1 ml nga tin-aw nga septum vial (8 x 40 mm Thermo Scientific).Ang mga tubo gitakpan ug gitakpan sa parafilm aron malikayan ang pag-alisngaw.Ang mga sample (n = 3) gilumlum sa 37 ° C o 60 ° C ug matag karon ug unya gibalit-ad aron makita ang gelation.Ang mga sample nga wala mag-gel gipalumlom sa labing menos usa ka semana.Bawasan ang NTMiSp disulfide bond nga adunay 10 mM DTT kada 10 µM nga protina.Aron pag-analisar sa gelation sa natural nga spider silk coatings, ang Swedish bridge spider giputol, ang duha ka nag-unang ampullated glands gibutang sa 200 μl sa 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 ug giputol aron tugotan ang coating nga magbulag gikan sa mga glandula..Ang mga sulud sa mga glandula natunaw sa buffer, 50 µl alang sa pagtino sa uga nga gibug-aton (pinaagi sa paglumlum sa bukas nga mga panaksan sa 60 °C hangtod sa kanunay nga gibug-aton) ug 150 µl alang sa gelation sa 37 °C.
Ang geometry / himan sa pagsukod gihimo sa stainless steel gamit ang parallel plate nga adunay taas nga diametro nga 20 mm ug usa ka gintang nga 0.5 mm.Init ang sample gikan sa 25 °C ngadto sa 45 °C ug balik ngadto sa 25 °C sa gikusgon nga 1 °C kada minuto gamit ang stainless steel ubos nga Peltier plate.Ang mga pagsukod sa vibrational gihimo sa frequency nga 0.1 Hz ug sa linear viscoelastic nga rehiyon sa materyal sa usa ka strain nga 5% ug 0.5% alang sa mga sample nga 100 mg / mL ug 300-500 mg / mL, matag usa.Gamit ug custom humidity chamber para malikayan ang evaporation.Gi-analisa ang datos gamit ang Prism 9.
Alang sa pagkolekta sa infrared (IR) spectra sa temperatura sa kwarto gikan sa 800 hangtod 3900 cm–1.Ang ATR device, ingon man ang kahayag nga agianan pinaagi sa spectrometer, gipurga sa uga nga sinala nga hangin sa wala pa ug sa panahon sa eksperimento.Ang mga solusyon (500 mg / mL aron maminusan ang pagsuyup sa tubig nga mga taluktok sa spectra) gipa-pipet sa mga kristal, ug ang mga gel (500 mg / mL) naporma sa wala pa ang pagsukod ug dayon gibalhin sa mga kristal (n = 3).Ang mga pag-scan sa 1000 natala nga adunay resolusyon nga 2 cm-1 ug zero duty cycle sa 2. Ang ikaduha nga derivative gikalkulo gamit ang OPUS (Bruker) gamit ang usa ka smoothing range nga siyam ka puntos.Gi-normalize ang spectra sa parehas nga rehiyon sa integrasyon tali sa 1720 ug 1580 cm-1 gamit ang F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".Sa ATR-IR spectroscopy, ang giladmon sa pagsulod sa usa ka infrared beam ngadto sa usa ka sample nagdepende sa wavenumber, nga miresulta sa mas kusog nga pagsuyup sa mas ubos nga mga wavenumber kaysa sa mas taas nga mga wavenumber.Kini nga mga epekto wala matul-id alang sa spectra nga gipakita sa Fig.3 tungod kay sila gamay kaayo (Supplementary Fig. 4).Ang gitul-id nga spectra alang niini nga numero gikalkulo gamit ang Bruker OPUS software.
Sa prinsipyo, ang usa ka komprehensibo nga quantification sa protina conformations posible human sa kasaligan nga deconvolution sa mga sangkap sulod sa amide I peak.Bisan pa, adunay pipila ka mga babag sa praktis.Ang kasaba sa spectrum mahimong makita isip (bakak) nga mga peak atol sa deconvolution.Dugang pa, ang peak tungod sa water bending motakdo sa posisyon sa amide I peak ug mahimong adunay susama nga magnitude alang sa mga sample nga adunay daghang tubig, sama sa aqueous gel nga gitun-an dinhi.Busa, wala kami mosulay sa hingpit nga pag-decompose sa amide I peak, ug ang among mga obserbasyon kinahanglan lamang nga ikonsiderar sa pagsuporta sa ubang mga pamaagi sama sa NMR spectroscopy.
Ang mga solusyon sa 50 mg / ml NT ug His-NT2RepCT gi-gel sa tibuok gabii sa 37 ° C.Ang hydrogel dayon lasaw sa 20 mM Tris-HCl (pH 8) ngadto sa konsentrasyon nga 12.5 mg/ml, giuyog ug maayo ug gipipet aron mabuak ang gel.Sunod, ang hydrogel lasaw 10 ka beses nga adunay 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl sa sample ang gipadapat sa usa ka tumbaga nga grid nga adunay sapaw sa formvar, ug ang sobra nga sample gikuha sa blotting nga papel.Ang mga sample gihugasan kaduha gamit ang 5 µl nga MilliQ nga tubig ug gimantsa sa 1% uranyl formate sulod sa 5 ka minuto.Kuhaa ang sobra nga mantsa gamit ang absorbent nga papel, unya pauga sa hangin ang mata.Gihimo ang imaging niini nga mga grid gamit ang FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN nga naglihok sa 100 kV.Ang mga hulagway girekord sa x 26,500 ug x 43,000 nga pagpadako gamit ang Veleta 2k × 2k CCD camera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany).Alang sa matag sample (n = 1), 10-15 nga mga imahe ang natala.Ang ImageJ (https://imagej.nih.gov/) gigamit alang sa pagtuki sa imahe ug pagsukod sa mga diametro sa fiber (n = 100, lainlaing mga lanot).Ang Prism 9 gigamit sa paghimo sa wala pares nga t-tests (two-tailed).Ang kahulogan sa Iyang-NT2RepCT ug NT fibrils mao ang 11.43 (SD 2.035) ug 7.67 (SD 1.389) nm, matag usa.Ang agwat sa pagsalig (95%) mao ang -4.246 hangtod -3.275.ang-ang sa kagawasan = 198, p <0.0001.
Ang 80 µl sa liquid sample nga adunay 10 µM thioflavin T (ThT) gisukod sa triplicate (n = 3) ubos sa static nga kondisyon gamit ang Corning 96-well black bottom clear bottom plates (Corning Glass 3881, USA).Ang mga kalainan sa fluorescence natala gamit ang 440 nm excitation filter ug 480 nm emission filter (FLUOStar Galaxy gikan sa BMG Labtech, Offenburg, Germany).Ang signal sa ThT dili saturated o mapalong, tungod kay ang mga eksperimento nga adunay lainlaing mga konsentrasyon sa ThT gihimo nga wala gibag-o ang intensity sa signal.Irekord ang pagsuyop sa 360 nm alang sa pagsukod sa haze.Alang sa mga eksperimento sa pagpugas, ang 100 mg/mL nga mga gel naporma sa 37° C., gisuspinde pag-usab, ug gigamit alang sa pagpugas sa molar ratios nga 5%, 10%, ug 20%.Gi-analisa ang datos gamit ang Prism 9.
Pagtunaw sa mga stock sa His-NT2RepCT ug NT>100 mg/mL sa yelo ug salain pinaagi sa 0.22 µm filter.Ang mga konsentrasyon gikalkulo pinaagi sa pagsukod sa absorbance sa 280 nm gamit ang Nanodrop.Sa mga atabay sa usa ka 96-well black non-binding plate (Corning) nga adunay tin-aw nga ilawom, ang mga sample lasaw sa 20 mg / ml sa 20 mM Tris-HCl pH 8 ug gisagol sa 5 μM ThT (katapusan nga konsentrasyon), kinatibuk-ang konsentrasyon sa sample 50 μl nga gidaghanon.Ang mga sample gihulagway matag 10 minuto sa 37 ° C sa usa ka CellObserver (Zeiss) nga mikroskopyo nga adunay gipasa nga light channel ug FITC excitation ug emission filter sets alang sa ThT imaging.Usa ka 20x/0.4 lens ang gigamit alang sa imaging.Ang Zen Blue (Zeiss) ug ImageJ (https://imagej.nih.gov/) gigamit alang sa pagtuki sa imahe.Giandam usab ang mga gel gikan sa mga solusyon sa NT ug His-NT2RepCT sa usa ka konsentrasyon nga 50 mg / mL nga adunay sulud nga 20 mM Tris pH 8 ug 5 µM ThT ug gilumlum sa 37 ° C sa 90 min.Ang mga piraso sa gel gibalhin ngadto sa usa ka bag-ong atabay nga adunay sulod nga 20 mM Tris, pH 8, ug 5 μM ThT sa usa ka dili-binding nga itom nga 96 well clear bottom plate.Pag-angkon og berde nga fluorescence ug hayag nga mga hulagway sa field sa 20x/0.4 nga pagpadako.Ang ImageJ gigamit alang sa pagtuki sa imahe.
Ang solusyon sa NMR spectra nakuha sa 310 K sa usa ka 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer nga adunay QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR samples nga adunay 10 mg/mL homogenous protein nga gimarkahan og 13C, 15N, dissolved sa 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Ang mga pagbalhin sa kemikal sa NT2RepCT sa pH 6.7 gigamit sa pag-assign sa peak 23 sa 2D spectrum sa 15N-HSQC.
Ang magic angle spinning solid NMR (MAS) spectra sa 13C, 15N-labeled hydrogels natala sa Bruker Avance III HD spectrometer sa 800 MHz nga adunay 3.2 mm 13C/15N{1H} electronless probe.Ang sample nga temperatura kontrolado gamit ang variable temperature gas stream sa 277 K. Two-dimensional dipole rotational resonance (DARR)76 ug radio frequency reconnection (RFDR)77 spectra nakuha sa MAS frequency nga 12.5 kHz ug 20 kHz, matag usa.Ang cross polarization (CP) gikan sa 1H hangtod 13C gihimo gamit ang linear ramp gikan sa 60.0 hangtod 48.0 kHz sa 1H, 61.3/71.6 kHz sa 13C (sa 12.5/20 kHz MAS) ug oras sa pagkontak 0.5-1 ms.Ang spinal6478 decoupling sa 73.5 kHz gigamit sa panahon sa pagkolekta sa datos.Ang oras sa pagkuha mao ang 10 milliseconds ug ang paglangan sa siklo 2.5 segundos.Ang single-linked Cα / Cβ correlations nga naobserbahan sa RFDR spectra gi-assign base sa kinaiya nga residue-type nga kemikal nga pagbalhin ug multiply-linked correlations sa DARR spectra.
Ang Zipper79 database (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) gigamit sa pagtimbang-timbang sa flutter tendencies ug Rosetta energy para sa NT, NTFlSp, ug NTMiSp.Ang database sa Zipper nag-compute sa Rosetta Energy80, nga naghiusa sa daghang mga libre nga function sa enerhiya aron mamodelo ug ma-analisar ang istruktura sa protina.Ang lebel sa enerhiya nga -23 kcal/mol o ubos nagpaila sa taas nga kalagmitan sa fibrillate.Ang ubos nga enerhiya nagpasabot ug mas kalig-on sa duha ka β-strands sa zipper conformation.Dugang pa, ang Waltz algorithm gigamit sa pagtagna sa amyloidogenic nga mga rehiyon sa NT, NTFlSp ug NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Ang solusyon sa protina sa NT gisagol sa 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer sa pH 5.5 ug 6.0 aron ipaubos ang pH sa pH 6 ug 7, matag usa.Ang katapusan nga konsentrasyon sa protina mao ang 100 mg / ml.
Ang mga pagsukod gihimo sa usa ka J-1500 CD spectrometer (JASCO, USA) gamit ang 300 μL cuvette nga adunay optical path nga 0.1 cm.Ang mga protina lasaw sa 10 μM (n = 1) sa 20 mM phosphate buffer (pH 8).Aron pag-analisar sa kalig-on sa protina sa presensya sa asin, ang mga protina gisusi sa samang konsentrasyon (n = 1) sa 20 mM phosphate buffer (pH 8) nga adunay 154 mM NaF o NaCl, matag usa.Ang mga pag-scan sa temperatura natala sa 222 nm gikan sa 25 ° C hangtod 95 ° C nga adunay rate sa pagpainit nga 1 ° C / min.Ang proporsiyon sa natively folded proteins gikalkulo gamit ang pormula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Dugang pa, lima ka spectra ang natala alang sa matag sample gikan sa 260 nm hangtod 190 nm sa 25 ° C ug pagkahuman sa pagpainit hangtod sa 95 ° C.Lima ka spectra ang gi-average, gipahapsay ug gi-convert sa molar ellipticity.Gi-analisa ang datos gamit ang Prism 9.
Ang fluorescence intensity sa Iyang-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) gisukod sa triplicate (n = 3) sa 96-well Corning plates nga adunay itom nga transparent bottom (Corning Glass 3881, USA) ubos sa static nga kondisyon.Sukda ang mga sample gamit ang fluorescence-based plate reader nga adunay excitation wavelength nga 395 nm ug irekord ang emission sa 509 nm sa wala pa ang gelation ug 2 ka oras sa ulahi sa 37°C.Gisusi ang datos gamit ang Prism 9.
Ang purine nucleoside phosphorylase activity assay kit (fluorometric method, Sigma Aldrich) gigamit sumala sa instruksyon sa tiggama.Aron sukdon ang kalihokan sa mga gel ug mga solusyon nga adunay His-NT-PNP, isagol ang 10 ng sa His-NT-PNP nga adunay 100 mg/mL NT sa total nga volume nga 2 µL tungod kay ang gel naghatag ug signal labaw sa detection interval sa set.Ang mga kontrol alang sa mga gel ug solusyon nga wala ang Iyang-NT-PNP gilakip.Ang mga pagsukod gihimo kaduha (n = 2).Human masukod ang kalihokan, gikuha ang sagol nga reaksyon ug gikuhaan og litrato ang gel aron masiguro nga ang gel magpabilin nga wala sa panahon sa pagsukod.Gi-analisa ang datos gamit ang Prism 9.
Alang sa dugang nga kasayuran sa disenyo sa pagtuon, tan-awa ang abstract sa pagtuon sa Kalikasan nga nalambigit niini nga artikulo.
Ang mga numero 1 ug 2 nagpresentar sa inisyal nga datos.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, ug 6, Supplementary Fig.3, dugang fig.5a, d, dugang fig.6 ug supplemental fig.8. Data Data gikan niini nga pagtuon gi-host sa Zenodo database https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Ang datos sa NMR nga nakuha niini nga pagtuon gi-post sa BMRBig repository ubos sa entry ID bmrbig36.Ang mga istruktura sa GFP ug PNP gikuha gikan sa PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. ug Johansson, J. Nagtuyok sa artipisyal nga silk sa lawalawa.Nasyonal nga Kemikal.biology.11, 309–315 (2015).
Babb, PL ug uban pa.Ang Nephila clavipes genome nagpasiugda sa pagkadaiya sa spider silk genes ug sa ilang komplikadong ekspresyon.Nasyonal nga Genette.49, 895–903 (2017).