347 12.7*1.24mm Stainless steel coiled tubing, Molecular nga mekanismo sa synchronous electrostatic condensation ug coaggregation sa α-synuclein ug tau

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Naggamit ka usa ka bersyon sa browser nga adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, gipakita namon ang site nga wala’y mga istilo ug JavaScript.
Ang mga slider nga nagpakita sa tulo ka mga artikulo matag slide.Gamita ang likod ug sunod nga mga buton sa paglihok sa mga slide, o ang slide controller nga mga buton sa katapusan aron sa paglihok sa matag slide.

347 Stainless Steel Pipe Detalye

347 12.7*1.24mm Stainless steel coiled tubing

Sa gawas Diametro: 6.00 mm OD hangtod sa 914.4 mm OD, Mga gidak-on hangtod sa 24" NB nga magamit Ex-stock, OD Size Steel Tubes magamit Ex-stock

SS 347 Pipe Thickness Range: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ug uban pa (0.5-12mm) O dili regular nga gidak-on nga ipahiangay kung gikinahanglan

Type: SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW Pipe |SS 347 Welded Pipe |SS 347 Gibuhat nga Pipe |SS 347 CDW Tubes, LSAW Pipe / Seam-welded / Gi-redraw

Porma: SS 347 Round Pipes/ Tubes, SS 347 Square Pipes/ Tubes, SS 347 Rectangular Pipe/ Tubes, SS 347 Coiled Tubes, SS 347 "U" Shape, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

Gitas-on: Single Random, Doble Random & Gikinahanglan Gitas-on Katapusan: Plain End, Beveled End, Treaded

Katapusan nga Proteksyon: Plastic Caps |Sa gawas nga Finish: 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Finish alang sa Stainless Steel Pipes, Tapuson sumala sa mga Kinahanglanon sa customer

Kondisyon sa Paghatud: Gi-anunsyo ug Adobo, Pinasinaw, Mahayag nga Gi-anunsyo, Cold Drawn

Pag-inspeksyon, Mga Ulat sa Pagsulay: Mga Sertipiko sa Pagsulay sa Mill, EN 10204 3.1, Mga Ulat sa Kemikal, Mga Ulat sa Mekanikal, Mga Ulat sa Pagsulay sa PMI, Mga Ulat sa Biswal nga Inspeksyon, Mga Ulat sa Pag-inspeksyon sa Ikatulo nga Partido, Naaprobahang NABL nga mga Ulat sa Lab, Makadaot nga Ulat sa Pagsulay, Dili Makadaot nga Mga Ulat sa Pagsulay

Pag-impake: Giputos sa Kahoy nga mga Kahon, Plastic Bag, Steel Strips nga Gibugkos, o sumala sa Gihangyo sa mga Kustomer

Mga Espesyal: Ang mga gidak-on ug mga Detalye gawas sa naa sa taas mahimong magama kung gihangyo

SS 347 Pipe Size Range: 1/2 pulgada NB, OD ngadto sa 24 pulgada

ASTM A312 347: Seamless ug straight-seam welded austenitic pipe nga gituyo alang sa taas nga temperatura ug kinatibuk-ang corrosive nga serbisyo.Ang filler metal dili tugotan sa panahon sa welding.

ASTM A358 347: Electric fusion welded austenitic pipe alang sa corrosive ug/o taas nga temperatura nga serbisyo.Kasagaran ang tubo hangtod sa 8 pulgada lamang ang gihimo sa kini nga detalye.Ang pagdugang sa metal nga filler gitugotan sa panahon sa welding.

ASTM A790 347: Seamless ug straight-seam welded ferritic/austenitic (duplex) pipe nga gituyo alang sa general corrosive nga serbisyo, nga adunay partikular nga pagpasiugda sa pagbatok sa stress corrosion cracking.

ASTM A409 347: Straight-seam o spiral-seam electric fusion welded dako nga diyametro austenitic light-wall pipe sa gidak-on 14" ngadto sa 30" nga adunay mga bungbong Sch5S ug Sch 10S alang sa corrosive ug/o taas

ASTM A376 347: Seamless austenitic pipe alang sa taas nga temperatura nga aplikasyon.

ASTM A813 347: Single-seam, single- o double-welded austenitic pipe alang sa taas nga temperatura ug kinatibuk-ang corrosive nga mga aplikasyon.

ASTM A814 347: Cold-worked welded austenitic pipe alang sa taas nga temperatura ug kinatibuk-ang corrosive nga serbisyo.

347H Stainless Steel Pipes Kemikal nga Komposisyon

Stainless Steel 347H Pipe Mechanical Properties

Stainless Steel 347H Pipes Pisikal nga mga Properties

Katumbas nga mga Grado para sa 347H Stainless Steel Pipe

Ang Amyloid alpha-synuclein (αS) aggregation usa ka timaan sa sakit nga Parkinson ug uban pang mga synucleinopathies.Bag-ohay lang, ang tau protein nga sagad nga nalangkit sa Alzheimer's disease nalambigit sa αS pathology ug nakit-an nga co-localize sa αS-rich inclusions, bisan kung ang molekular nga mekanismo sa coaggregation sa duha ka protina nagpabilin nga dili klaro.Gi-report namon dinhi nga ang hugna sa αS nagbulag sa mga likido nga condensate pinaagi sa electrostatic complex condensation nga adunay positibo nga mga polypeptide sama sa tau.Depende sa affinity sa αS alang sa polycations ug ang rate sa valence depletion sa coagulation network, ang mga clots moagi sa paspas nga gelation o coalescence nga gisundan sa hinay nga amyloid aggregation.Pinaagi sa paghiusa sa usa ka hugpong sa mga advanced biophysical techniques, nakahimo kami sa pag-ila sa liquid-liquid αS/Tau phase separation ug pag-ila sa mga importanteng hinungdan nga mosangpot sa pagporma sa heterogeneous aggregates nga adunay duha ka protina sa usa ka liquid protein condensate.
Gawas pa sa mga compartment sa lamad, ang spatial separation sa mga cell mahimo usab nga makab-ot pinaagi sa pagporma sa mga dato sa protina, sama sa likido nga dasok nga mga lawas nga gitawag biomolecular condensates o droplets, pinaagi sa proseso nga nailhan nga liquid-liquid phase separation (LLPS).Kini nga mga tinulo naporma pinaagi sa multivalent nga temporal nga interaksyon, kasagaran tali sa mga protina o protina ug RNA, ug nagsilbi sa lain-laing mga gimbuhaton sa halos tanang buhing sistema.Ang daghang gidaghanon sa mga protina nga makahimo sa LLP nagpakita sa mga han-ay sa ubos nga pagkakomplikado nga hilabihan ka dili maayo sa kinaiyahan ug sa pagporma sa biomolecular condensates3,4,5.Daghang mga eksperimento nga mga pagtuon ang nagpadayag sa flexible, kasagaran disordered, ug multivalent nga kinaiya sa mga protina nga naglangkob niini nga mga liquid-like condensates, bisan tuod gamay nga nahibal-an mahitungod sa piho nga molekular determinants nga nagkontrol sa pagtubo ug pagkahinog niini nga mga condensates ngadto sa usa ka mas solid-sama. estado..
Ang bag-ong datos nagsuporta sa pangagpas nga ang aberrant protein-driven LLPS ug ang pagbag-o sa mga tinulo ngadto sa solidong mga istruktura mahimong may kalabutan nga mga agianan sa cellular nga mosangpot sa pagporma sa dili matunaw nga makahilo nga mga aggregate nga kasagaran mga timaan sa degenerative nga mga sakit.Daghang mga LLPS-associated intrinsically disordered proteins (IDPs), nga sagad gikargahan ug flexible, dugay na nga nakig-uban sa neurodegeneration pinaagi sa proseso sa amyloid aggregation.Sa partikular, ang biomolecular IDP condensates sama sa FUS7 o TDP-438 o mga protina nga adunay dako nga ubos nga komplikado nga mga dominyo sama sa hnRNPA19 gipakita sa edad ngadto sa gel-sama o bisan solid nga mga porma pinaagi sa usa ka proseso nga gitawag fluidization.compound.ngadto sa solid phase transition (LSPT) isip usa ka function sa oras o agig tubag sa pipila ka post-translational modifications o pathologically important mutations1,7.
Ang laing IDP nga nakig-uban sa LLPS sa vivo mao ang Tau, usa ka microtubule-associated disordered protein kansang amyloid aggregation nalambigit sa Alzheimer's disease10 apan bag-o lang usab nga nalambigit sa Parkinson's disease (PD) ug uban pang synaptic nuclear proteinopathies 11, 12, 13 adunay kalabutan.Gipakita ang Tau nga kusang magbulag gikan sa solusyon/cytoplasm tungod sa paborableng electrostatic nga mga interaksyon14, nga miresulta sa pagkaporma sa tau-enriched droplets nga nailhang electrostatic coacervates.Naobserbahan usab nga kini nga matang sa dili piho nga interaksyon mao ang nagpalihok nga kusog luyo sa daghang biomolecular condensates sa kinaiyahan15.Sa kaso sa usa ka protina nga tau, ang electrostatic aggregation mahimong maporma pinaagi sa yano nga aggregation, diin ang magkaatbang nga charge nga mga rehiyon sa protina mag-trigger sa proseso sa cleavage, o pinaagi sa komplikadong aggregation pinaagi sa interaksyon sa negatibo nga charged polymers sama sa RNA.
Karong bag-o, ang α-synuclein (αS), usa ka amyloid IDP nga nalambigit sa PD ug uban pang mga sakit nga neurodegenerative nga kolektibo nga nailhan nga synucleinopathy17,18, gipakita sa mga modelo sa cellular ug hayop19,20 nga gikonsentrar sa mga condensate sa protina nga adunay kinaiya nga sama sa likido.Gipakita sa mga pagtuon sa vitro nga ang αS nakaagi sa LLPS pinaagi sa yano nga panagsama pinaagi sa kadaghanan nga hydrophobic nga mga interaksyon, bisan kung kini nga proseso nanginahanglan labi ka taas nga konsentrasyon sa protina ug atypically taas nga oras sa paglumlum19,21.Kung ang mga condensate nga adunay αS nga naobserbahan sa vivo naporma niini o uban pang mga proseso sa LLPS nagpabilin nga usa ka hinungdan nga wala masulbad nga isyu.Sa susama, bisan kung ang αS amyloid aggregation naobserbahan sa mga neuron sa PD ug uban pang mga synucleinopathies, ang eksakto nga mekanismo diin ang αS nakaagi sa intracellular amyloid aggregation nagpabilin nga dili klaro, tungod kay ang sobrang pagpahayag sa kini nga protina dili makita nga mag-aghat sa kini nga proseso sa iyang kaugalingon.Ang dugang nga kadaot sa cellular kanunay gikinahanglan, nga nagsugyot nga ang pipila nga mga lokasyon sa cellular o microenvironment gikinahanglan alang sa renucleation sa intracellular αS amyloid assemblies.Ang usa ka cellular nga palibot nga labi ka dali nga magtipon mahimo nga ang sulod sa mga condensate sa protina 23 .
Makapainteres, ang αS ug tau nakit-an nga nag-co-localize sa mga sakit nga kinaiya sa mga tawo nga adunay sakit nga Parkinson ug uban pang mga synucleinopathies 24,25 ug ang mga eksperimento nagreport sa usa ka synergistic nga pathological nga relasyon tali sa duha nga mga protina 26,27 nga nagsugyot sa usa ka potensyal nga relasyon tali sa panagsama αS ug tau sa mga sakit nga neurodegenerative.sakit.Ang αS ug tau nakit-an nga nakig-uban ug nagpasiugda sa panagsama sa usag usa sa vitro ug sa vivo 28,29 ug ang mga heterogenous nga aggregate nga gilangkoban niining duha ka mga protina naobserbahan sa utok sa mga pasyente nga adunay synucleinopathies 30.Bisan pa, gamay ra ang nahibal-an bahin sa molekular nga sukaranan sa interaksyon tali sa αS ug tau ug ang mekanismo sa co-aggregation niini.Ang αS gikataho nga nakig-interact sa tau pinaagi sa usa ka electrostatic nga atraksyon tali sa negatibo kaayo nga gikargahan nga C-terminal nga rehiyon sa αS ug sa sentral nga proline-rich nga rehiyon sa tau, nga gipadato usab sa mga residu nga positibo nga gikargahan.
Sa kini nga pagtuon, gipakita namon nga ang αS mahimo gyud nga magbulag sa mga tinulo pinaagi sa electrostatic complex condensation sa presensya sa tau protein, sukwahi sa interaksyon niini sa ubang mga positibo nga gikarga nga polypeptides sama sa poly-L-lysine (pLK), ug sa kini nga proseso.Ang αS naglihok isip molekula sa scaffold alang sa droplet network.Nahibal-an namon ang mamatikdan nga mga kalainan sa proseso sa pagkahinog sa electrostatic αS coacervates, nga nalangkit sa mga kalainan sa valency ug kusog sa interaksyon sa mga protina nga nalambigit sa coacervate network.Makapainteres, among naobserbahan ang co-aggregation sa αS ug tau amyloid nga mga protina sa dugay na nga mga likido nga coacervates ug giila ang pipila ka mga hinungdan nga hinungdan nga hinungdan sa paghiusa sa duha nga mga protina sa ingon nga mga coacervates.Dinhi among gihulagway sa detalye kini nga proseso, nga usa ka posible nga mekanismo sa molekula nga nagpahipi sa colocalization sa duha ka mga protina sa mga inklusyon nga espesipiko sa sakit.
Ang αS adunay taas nga anionic nga C-terminal nga ikog sa neyutral nga pH (Fig. 1a), ug among gi-hypothesize nga kini mahimong moagi sa LLPS pinaagi sa condensation sa electrostatic complexes nga adunay polycationic disordered polypeptide molecules.Gigamit namo ang usa ka 100-residue poly-L-lysine (pLK) isip sugod nga molekula sa modelo tungod sa positibo nga charge ug disordered nga polymeric nga kinaiya niini sa neutral pH 32. Una, among gikumpirma nga ang pLK nakig-uban sa Ct domain sa αS pinaagi sa Solution NMR spectroscopy (Figure 1b) gamit ang 13C/15N-labeled αS sa presensya sa pagdugang sa αS:pLK molar ratios.Ang interaksyon sa pLK sa Ct-domain sa αS nagpakita sa iyang kaugalingon sa mga kasamok sa pagbalhin sa kemikal ug usa ka pagkunhod sa peak intensity sa kini nga rehiyon sa protina.Makapainteres, kung gisagol namon ang αS sa pLK sa usa ka konsentrasyon sa αS nga gibanabana.5–25 µM sa presensya sa polyethylene glycol (5–15% PEG-8) (tipikal nga LLPS buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) diha-diha dayon miagi kami sa lapad nga natad sa pagporma sa protina .Ang mga tinulo naobserbahan gamit ang fluorescence (WF) ug bright-field (BF) microscopy (Fig. 1c).1-5 µm droplets nga adunay concentrated αS (gidugang 1 µM AlexaFluor488-labeled αS, AF488-αS), ang ilang mga electrostatic nga kabtangan mahimong makuha gikan sa ilang resistensya sa 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) ug ang pagkasensitibo niini sa usa ka pagtaas sa konsentrasyon sa NaCl (Fig. 1c).Ang fluid-like nga kinaiya sa mga coacervates sa αS/pLK electrostatic complex gipakita pinaagi sa ilang abilidad sa pag-fuse sulod sa milliseconds (Fig. 1d).Gamit ang turbidimetry, gi-quantiate namo ang pagporma sa mga droplets ubos niini nga mga kondisyon, gipamatud-an ang electrostatic nga kinaiya sa nag-unang interaksyon nga may kalabutan sa kalig-on niini (Fig. 1e), ug gisusi ang epekto sa nagkalain-laing polymer ratios sa proseso sa LLPS (Fig. 1f).Bisan kung ang pagporma sa tinulo naobserbahan sa usa ka halapad nga mga ratios sa polimer, ang proseso pabor kaayo kung ang pLK sobra sa αS.Naobserbahan usab ang mga LLP gamit ang lainlain nga kemikal nga ahente sa pagbalhin nga dextran-70 (70 kDa) o gamit ang lainlaing mga pormat sa sample, lakip ang mga drop sa slide sa salamin, mga atabay sa microplate sa lainlaing mga materyales, Eppendorf o quartz capillaries.
usa ka eskematiko nga representasyon sa lainlaing mga rehiyon sa protina sa mga variant sa WT-αS ug ΔCt-αS nga gigamit niini nga pagtuon.Ang amphipathic N-terminal domain, ang hydrophobic amyloid-forming (NAC) nga rehiyon, ug ang negatibo nga charge nga C-terminal domain gipakita sa asul, orange, ug pula, matag usa.Ang Net Charge Per Residual (NCPR) nga mapa sa WT-αS gipakita.b NMR analysis sa αS / pLK interaction sa pagkawala sa macromolecular clumps.Samtang nagkataas ang konsentrasyon sa pLK (αS:pLK molar ratios nga 1:0.5, 1:1.5, ug 1:10 gipakita sa light green, green, ug dark green, matag usa).c Coacervate αS/pLK (molar ratio 1:10) sa 25 µM (1 µM AF488-labeled αS o Atto647N-labeled pLK para sa WF imaging) sa LLPS buffer (ibabaw) o dugangan og 500 mM NaCl (ubos sa wala) o human sa 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; ubos sa tuo).Scale bar = 20 µm.d Representante nga mikroskopiko nga mga hulagway sa BF droplet fusion sa αS / pLK (molar ratio 1:10) sa konsentrasyon nga 25 μM;ang mga pana nagpakita sa paghiusa sa tagsa-tagsa nga mga tinulo (pula ug dalag nga mga pana) ngadto sa usa ka bag-ong tinulo (orange nga arrow) sulod sa 200 ms).Scale bar = 20 µm.e Light scattering (sa 350 nm) αS/pLK aggregation sa LLPS buffer sa wala pa ug human sa pagdugang sa 500 mM NaCl o 10% 1,6-HD sa 25 μM αS (N = 3 sample replikates, mean ug standard deviation gipakita usab).f BF image (ibabaw) ug light scattering analysis (sa 350 nm, bottom) sa αS/pLK aggregation sa 25 μM αS uban ang pagtaas sa αS:pLK molar ratio (N = 3 sample replicates, mean ug standard deviation gipakita usab).Scale bar = 10 µm.Ang scale bar sa usa ka imahe nagpakita sa sukod sa tanan nga mga imahe sa usa ka panel.Ang hilaw nga datos gihatag sa porma sa hilaw nga mga file sa datos.
Base sa among mga obserbasyon sa αS/pLK electrostatic complex condensation ug sa miaging mga obserbasyon sa αS isip molekula sa kliyente sa tau/RNA condensate pinaagi sa direktang interaksyon sa tau31, among gipanghinaot nga ang αS ug tau mahimong mag-co-segregate sa solvent kung wala ang RNA. kondensasyon.pinaagi sa electrostatic complexes, ug ang αS mao ang scaffold protein sa αS/Tau coacervates (tan-awa ang tau charge distribution sa Figure 2e).Naobserbahan namon nga kung ang 10 μM αS ug 10 μM Tau441 (nga adunay 1 μM AF488-αS ug 1 μM Atto647N-Tau, matag usa) gisagol sa LLPS buffer, dali silang nagporma sa mga aggregate sa protina nga adunay parehong mga protina, ingon sa nakita sa WF microscopy.(Fig. 2a).Ang colocalization sa duha ka protina sa mga tinulo gipamatud-an sa confocal (CF) microscopy (Supplementary Fig. 1a).Ang susama nga kinaiya naobserbahan sa dihang ang dextran-70 gigamit isip usa ka ahente sa aggregation (Supplementary Fig. 1c).Gamit ang bisan hain nga FITC-label nga PEG o dextran, among nakita nga ang duha ka crowding agent parehas nga giapod-apod sa mga sample, nga wala magpakita sa segregasyon o asosasyon (Supplementary Fig. 1d).Hinunoa, kini nagsugyot nga niini nga sistema ilang gipasiugdahan ang pagbulag sa hugna pinaagi sa macromolecular crowding nga mga epekto, tungod kay ang PEG usa ka preferentially stable nga crowding agent, sama sa makita sa ubang LLP systems33,34.Kini nga mga tinulo nga puno sa protina sensitibo sa NaCl (1 M) apan dili sa 1,6-HD (10% v / v), nga nagpamatuod sa ilang mga electrostatic properties (Supplementary Fig. 2a, b).Ang ilang fluid nga kinaiya gipamatud-an pinaagi sa pag-obserbar sa millisecond merging droplet nga mga panghitabo gamit ang BF microscopy (Fig. 2b).
usa ka Confocal (CF) nga mikroskopya nga mga hulagway sa αS / Tau441 coacervates sa LLPS buffer (10 μM sa matag protina, 0.5 μM sa AF488-label nga αS ug Atto647N-label nga Tau441).b Representative differential interference contrast (DIC) nga mga hulagway sa αS / Tau441 droplet fusion nga mga panghitabo (10 μM alang sa matag protina).c Phase diagram base sa light scattering (sa 350 nm) sa Tau441 LLPS (0–15 µM) sa wala (wala) o presensya (tuo) sa 50 µM αS.Ang mas init nga mga kolor nagpaila sa dugang nga pagsabwag.d Kahayag nga pagsabwag sa αS / Tau441 LLPS nga mga sample nga adunay pagtaas sa konsentrasyon sa αS (Tau441 sa 5 µM, N = 2-3 sample repetitions sumala sa gipakita).e Schematic nga representasyon sa pipila ka mga variant sa protina sa tau ug lain-laing mga rehiyon sa protina nga gigamit niini nga pagtuon: negatibo nga gikargahan nga N-terminal domain (pula), proline-rich nga rehiyon (asul), microtubule-binding domain (MTBD, gipasiugda sa orange), ug spiral nga nagporma sa amyloid.filament regions (PHF) nga nahimutang sulod sa MTBD (gray).Ang Net Charge Per Residue (NCPR) nga mapa sa Tau441 gipakita.f Gamit ang 1 µM AF488-labeled αS ug Atto647N-labeled ΔNt-, gamit ang 1 µM AF488-labeled αS o ΔCt-αS sa presensya sa ΔNt-Tau (ibabaw, 10 µM kada protina) o K18 (ubos, 50 µM ) ) ) micrographs sa WF gipamub-ot sa LLPS o K18 buffer.Ang mga scale bar sa usa ka imahe nagrepresentar sa sukod sa tanan nga mga imahe sa usa ka panel (20 µm alang sa mga panel a, b ug f).Ang hilaw nga datos alang sa mga panel c ug d gihatag isip hilaw nga mga file sa datos.
Aron masulayan ang papel sa αS niining proseso sa LLPS, una namong gisusi ang epekto sa αS sa droplet stability pinaagi sa nephelometry gamit ang nagkataas nga konsentrasyon sa NaCl (Fig. 2c).Kung mas taas ang konsentrasyon sa asin sa mga sample nga adunay αS, mas taas ang mga kantidad sa pagsabwag sa kahayag (sa 350 nm), nga nagpaila sa pagpalig-on nga papel sa αS sa kini nga sistema sa LLPS.Ang susamang epekto maobserbahan pinaagi sa pagdugang sa konsentrasyon sa αS (ug busa ang αS:Tau441 ratio) ngadto sa gibanabana.10 ka pilo nga pagtaas kalabot sa konsentrasyon sa tau (5 µM) (Fig. 2d).Aron ipakita nga ang αS usa ka protina sa scaffold sa mga coacervates, nakahukom kami nga imbestigahan ang pamatasan sa LLPS-disrupted Tau mutant, nga kulang sa negatibo nga gikargahan nga N-terminal nga rehiyon (mga nahabilin 1-150, tan-awa ang Fig. 2e) nga gitawag ΔNt-Tau.Gipamatud-an sa WF microscopy ug nephelometry nga ang ΔNt-Tau mismo wala moagi sa LLPS (Fig. 2f ug Supplementary Fig. 2d), ingon sa gitaho kaniadto nga 14. Apan, sa dihang ang αS gidugang sa mga dispersion solution niining giputol nga Tau nga variant, ang proseso sa LLPS hingpit nga gipahiuli uban sa tinulo densidad duol sa tinulo densidad sa bug-os nga gidak-on nga mga solusyon sa Tau ug αS ubos sa susamang mga kondisyon ug protina konsentrasyon.Kini nga proseso mahimo usab nga maobserbahan ubos sa mga kondisyon sa ubos nga macromolecular crowding (Supplementary Fig. 2c).Ang papel sa C-terminal αS nga rehiyon, apan dili ang tibuok nga gitas-on niini, sa proseso sa LLPS gipakita pinaagi sa pagpugong sa droplet formation gamit ang C-terminal truncated αS variant nga kulang sa residues 104-140 (Fig. 1a) sa (ΔCt- αS) protina (Fig. 2f ug Supplementary Fig. 2d).Ang colocalization sa αS ug ΔNt-Tau gikumpirma sa confocal fluorescence microscopy (Supplementary Fig. 1b).
Aron masulayan pa ang mekanismo sa LLPS tali sa Tau441 ug αS, usa ka dugang nga variant sa Tau ang gigamit, nga mao ang gipares nga helical filament core (PHF) fragment sa microtubule-binding domain (MTBD), nga kung kini adunay upat nga mga kinaiya nga gibalikbalik nga mga domain, nga sagad nailhan usab. isip tipik sa K18 (tan-awa ang Fig. 2e).Bag-ohay lang nga gitaho nga ang αS mas gusto nga magbugkos sa usa ka protina nga tau nga nahimutang sa usa ka domain nga puno sa proline sa usa ka pagkasunod-sunod nga nag-una sa domain nga nagbugkos sa microtubule.Bisan pa, ang rehiyon sa PHF dato usab sa mga residue nga positibo nga gikargahan (tan-awa ang Figure 2e), labi na ang lysine (15% residues), nga nag-aghat kanamo sa pagsulay kung kini nga rehiyon nag-amot usab sa pagkondensasyon sa αS / Tau complex.Naobserbahan namon nga ang K18 lamang dili maka-trigger sa LLPS sa mga konsentrasyon hangtod sa 100 μM sa ilawom sa mga kondisyon nga gisulayan (LLPS buffer nga adunay 15% PEG o 20% dextran) (Figure 2f).Apan, sa dihang gidugang namo ang 50 µM αS ngadto sa 50 µM K18, ang paspas nga pagporma sa mga droplet sa protina nga adunay K18 ug αS naobserbahan sa nephelometry (Supplementary Fig. 2d) ug WF microscopy (Fig. 2f).Sama sa gipaabot, ang ΔCt-αS wala makahimo sa pagpasig-uli sa LLPS nga kinaiya sa K18 (Fig. 2f).Atong namatikdan nga ang αS/K18 aggregation nagkinahanglan og gamay nga mas taas nga mga konsentrasyon sa protina aron maaghat ang LLPS kumpara sa αS/ΔNt-Tau o αS/Tau441, ang ubang mga butang managsama.Kini nahiuyon sa mas lig-on nga interaksyon sa αS C-terminal nga rehiyon nga adunay proline-rich Tau domain kumpara sa microtubule-binding domain, sama sa gihulagway kaniadto 31.
Gihatag nga ang ΔNt-Tau dili makahimo sa LLPS kung wala ang αS, gipili namon kini nga variant sa Tau ingon usa ka modelo alang sa pagkilala sa αS / Tau LLPS nga gihatag ang kayano niini sa mga sistema sa LLPS nga adunay bug-os nga gitas-on nga Tau (isotype, Tau441 / Tau441).nga adunay komplikado (heterotypic, αS/Tau441) nga mga proseso sa aggregation.Gikumpara namo ang lebel sa αS aggregation (isip bahin sa condensed phase protein, fαS, c) sa αS / Tau ug αS / ΔNt-Tau nga mga sistema pinaagi sa centrifugation ug dispersed phase SDS-PAGE analysis (tan-awa ang 2e), nakit-an ang susama kaayo nga mga bili alang sa tanan nga mga protina sa parehas nga konsentrasyon.Sa partikular, nakuha namon ang fαS, c 84 ± 2% ug 79 ± 7% alang sa αS / Tau ug αS / ΔNt-Tau, matag usa, nga nagsugyot nga ang heterotypic nga interaksyon tali sa αS ug tau mas labaw sa interaksyon tali sa tau molekula.tali sa.
Ang interaksyon sa nagkalain-laing polycations ug ang epekto sa proseso sa condensation sa αS kinetics unang gitun-an sa fluorescence recovery human sa photobleaching (FRAP) nga pamaagi.Gisulayan namon ang αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau ug αS / pLK coacervates (100 μM αS nga gidugangan sa 2 μM αS AF488-αS ug 100 μM Tau441 o ΔNt-Tau o 1 mM pLK).Ang datos nakuha sulod sa unang 30 ka minuto human sa pagsagol sa sample nga mga sangkap.Gikan sa representante nga mga hulagway sa FRAP (Fig. 3a, αS / Tau441 condensation) ug ang ilang katugbang nga time course curves (Fig. 3b, Supplementary Fig. 3), makita nga ang αS kinetics susama kaayo sa Tau441 coacervates.ug ΔNt-Tau, nga mas paspas sa pLK.Ang kalkulado nga diffusion coefficients alang sa αS sulod sa coacervate sumala sa FRAP (sama sa gihulagway ni Kang et al. 35) mao ang D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ug D = 0.026 ± 0.008 µm2/s para sa αS/TauS/s para sa αS/TauS/s441 ang αS/ sistema.pLK, Tau, ug D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, matag usa (Fig. 3c).Bisan pa, ang diffusion coefficient αS sa dispersed phase mao ang daghang mga order sa magnitude nga mas taas kaysa sa tanan nga mga condensed phase, nga gitino sa Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, tan-awa ang Supplementary Fig. 3) ubos sa parehas nga mga kondisyon (LLPS buffer) apan kung wala ang polycations ( D = 8 ± 4 µm2/s).Busa, ang mga kinetics sa αS nga paghubad sa kamahinungdanon pagkunhod sa coacervates kumpara sa mga protina sa nagkatibulaag nga hugna tungod sa paglitok sa molekular crowding epekto, bisan tuod ang tanan nga coacervates nagpabilin liquid-sama sa mga kabtangan sa panahon sa unang tunga sa oras human sa ilang pagporma, sukwahi sa tau phase.mas paspas nga kinetics sa pLK condensate.
a-c FRAP analysis sa αS dynamics (2% AF488-labeled αS) sa electrostatic coacervates.Ang mga representatibo nga mga hulagway sa αS / Tau441 FRAP assays sa triplicate gipakita sa (a), diin ang pula nga mga lingin nagpaila sa dekolor nga mga lugar.Ang scale bar kay 5 µm.b Average nga FRAP curves ug (c) kalkulado nga diffusion coefficients (D) alang sa 5-6 (N) lain-laing droplets gikan sa tulo ka mga eksperimento gamit ang 100 µM αS ug equimolar nga konsentrasyon sa Tau441 (pula) o ΔNt-Tau (asul) o pLK (berde) sa napulo ka beses ang konsentrasyon sa LLPS.Ang standard deviation sa FRAP curve gipakita sa shaded color.Alang sa pagtandi, ang diffusion coefficient αS sa dispersed phase gitino sa triplicate gamit ang fluorescence correlation spectroscopy (FCS) (tan-awa ang Supplement Figure 3 ug mga pamaagi alang sa dugang nga impormasyon).d Ang padayon nga X-band EPR spectra sa 100 μM TEMPOL-122-αS sa LLPS buffer nga walay polycation (itom) o sa presensya sa 100 μM Tau441 (pula) o ΔNt-Tau (asul) o 1 mM pLK (berde).Ang inset nagpakita sa usa ka gipadako nga pagtan-aw sa lig-on nga mga linya sa uma diin ang labing katingad-an nga mga pagbag-o nahitabo.e Binding curves sa 50 μM TEMPOL-122-αS nga adunay lain-laing polycations kung wala ang LLPS (walay PEG).Ang pagkunhod sa amplitude sa banda III kumpara sa banda II (IIII / III) sa normal nga EPR spectrum gipakita aron madugangan ang molar ratios sa Tau441 (pula), ΔNt-Tau (asul) ug pLK (berde).Ang mga kolor nga linya nagpakita nga angay sa datos gamit ang usa ka rough binding model nga adunay n managsama ug independente nga binding sites sa matag kurba.Ang hilaw nga datos gihatag sa porma sa hilaw nga mga file sa datos.
Isip usa ka komplemento, among gisusi ang dynamics sa αS sa nagkalain-laing coacervates gamit ang directed spin labeling (SDSL) ug padayon nga electron paramagnetic resonance (CW-EPR).Kini nga pamaagi napamatud-an nga mapuslanon kaayo sa pagreport sa pagka-flexible ug dynamics sa IDP nga adunay realistiko nga nahabilin nga resolusyon36,37,38.Sa kini nga katuyoan, nagtukod kami mga nahabilin nga cysteine ​​​​sa usa ka mutant nga Cys ug gigamit ang 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) spin probe.Ang mga derivatives sa maleimide gimarkahan kini.Labaw nga espesipiko, among gisulod ang TEMPOL probes sa posisyon 122 o 24 αS (TEMPOL-122-αS ug TEMPOL-24-αS).Sa una nga kaso, gipunting namon ang C-terminal nga rehiyon sa protina, nga nalangkit sa interaksyon sa mga polycation.Hinunoa, ang posisyon 24 makahatag kanato og impormasyon mahitungod sa kinatibuk-ang dinamika sa mga protina sa condensate.Sa duha ka mga kaso, ang mga signal sa EPR nga nakuha alang sa mga protina sa nagkatibulaag nga hugna katumbas sa nitroxide radicals sa paspas nga paglihok nga estado.Human sa pagbulag sa hugna sa presensya sa tau o pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 o ΔNt-Tau sa ratio nga 1: 1 o pLK sa ratio nga 1:10), usa ka pagtaas sa relatibong peak intensity ang nakita sa ang EPR spectrum sa αS.Ang linya sa pagkawala gipalapad, nga nagpakita sa pagkunhod sa αS reorientation kinetics sa mga tinulo kumpara sa protina sa dilute phase (Fig. 3d, Supplementary Fig. 4a).Kini nga mga pagbag-o mas gipahayag sa posisyon nga 122. Samtang sa posisyon 24 ang presensya sa pLK wala makaapekto sa kinetics sa probe, sa posisyon nga 122 ang spectral line nga porma nausab pag-ayo (Supplementary Fig. 4a).Sa diha nga misulay kami sa pagmodelo sa spectra sa posisyon 122 sa duha ka αS / polycation system gamit ang isotropic nga modelo (Supplementary Figure 5a) nga sagad gigamit sa paghulagway sa dynamics sa spin-labeled IDP38,39, wala namo matukod pag-usab ang experimental spectra..Spectral simulation sa posisyon sa 24 spins contrasts (Supplementary Fig. 5a).Kini nagsugyot nga adunay mga pinalabi nga mga posisyon sa luna sa spin configurations sa C-terminal nga rehiyon sa αS sa presensya sa polycations.Kung gikonsiderar ang tipik sa αS sa condensed phase ubos sa eksperimento nga mga kondisyon sa EPR (84 ± 2%, 79 ± 7%, ug 47 ± 4% alang sa αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, ug αS / pLK, matag usa-tan-awa ang Supplementary Fig. 2e sa pag-analisa sa datos c), makita nga ang pagpalapad nga nakit-an sa pamaagi sa EPR nag-una nga nagpakita sa interaksyon sa C-terminal nga rehiyon sa αS nga adunay lainlaing mga polycation sa condensed phase (ang panguna nga pagbag-o kung gigamit ang TEMPOL-122- αS), ug dili protina condensation.Ang pagtaas sa microviscosity naobserbahan sa probe.Sama sa gipaabot, ang EPR spectrum sa protina ubos sa mga kondisyon gawas sa LLPS hingpit nga napasig-uli sa dihang ang 1 M NaCl gidugang sa sagol (Supplementary Fig. 4b).Sa kinatibuk-an, ang among datos nagsugyot nga ang mga pagbag-o nga nakit-an sa CW-EPR nag-una nga nagpakita sa interaksyon sa C-terminal nga rehiyon sa αS nga adunay lainlaing polycations sa condensed phase, ug kini nga interaksyon makita nga mas lig-on sa pLK kay sa Tau.
Aron makakuha og dugang nga impormasyon sa istruktura bahin sa mga protina sa coacervate, nakahukom kami nga tun-an ang sistema sa LLPS gamit ang NMR sa solusyon.Bisan pa, mahimo ra naton mahibal-an ang bahin sa αS nga nahabilin sa nagkatibulaag nga hugna, nga mahimo’g tungod sa pagkunhod sa dinamikong protina sa sulod sa coacervate ug usa ka dasok nga bahin sa ilawom sa solusyon sa pagtuki sa NMR.Kung among gi-analisar ang istruktura ug dinamika sa protina nga nahabilin sa nagkatibulaag nga hugna sa sample sa LLPS gamit ang NMR (Supplementary Fig. 5c, d), among namatikdan nga ang protina naglihok halos parehas sa presensya sa pLK ug ΔNt-Tau, pareho sa nga naa sa sekondaryang istruktura ug dinamika sa backbone sa protina, nga gipadayag sa mga eksperimento sa ikaduha nga pagbalhin sa kemikal ug R1ρ nga pagpahayahay.Gipakita sa datos sa NMR nga ang C-terminus sa αS nag-antus sa usa ka mahinungdanon nga pagkawala sa conformational flexibility samtang nagpabilin ang dili maayo nga kinaiya niini, sama sa uban nga pagkasunod-sunod sa protina, tungod sa mga interaksyon niini sa polycations.
Tungod kay ang pagpalapad sa signal sa CW-EPR nga naobserbahan sa TEMPOL-122-αS condensed phase nagpakita sa interaksyon sa protina sa polycations, naghimo kami usa ka EPR titration aron mahibal-an ang pagbugkos sa αS sa lainlaing mga polycation kung wala ang LLPS (walay akumulasyon sa Buffer LLPS), nga nagsugyot nga ang mga interaksyon parehas sa dilute ug concentrated nga mga hugna (nga gipamatud-an sa among datos, Supplementary Fig. 4a ug Supplementary Fig. 6).Ang tumong mao ang pagtan-aw kon ang tanan nga mga coacervate, bisan pa sa ilang komon nga fluid-like properties, nagpakita sa bisan unsa nga nagpahiping differential behavior sa molekular nga lebel.Sama sa gipaabot, ang EPR spectrum gipalapad uban sa pagdugang sa polycation konsentrasyon, nga nagpakita sa usa ka pagkunhod sa molecular flexibility tungod sa molekular interaksyon sa tanan nga mga pakig-uban partner hapit sa saturation (Fig. 3e, Supplementary Fig. 6).Ang pLK nakab-ot kini nga saturation sa mas ubos nga molar ratio (polycation:αS) kumpara sa ΔNt-Tau ug Tau441.Sa tinuud, ang pagtandi sa datos sa usa ka gibanabana nga modelo nga nagbugkos nga nag-asoy nga n parehas ug independente nga mga site nga nagbugkos nagpakita nga ang dayag nga dissociation constant sa pLK (~ 5 μM) usa ka han-ay sa magnitude nga mas ubos kaysa sa Tau441 o ΔNt-Tau (~ 50 μM ).µM).Bisan kung kini usa ka kasarangan nga pagbanabana, kini nagsugyot nga ang αS adunay mas taas nga kalambigitan alang sa mas simple nga mga polycation nga adunay padayon nga positibo nga mga rehiyon sa pagsingil.Tungod sa kini nga kalainan sa kalambigitan tali sa αS ug lainlaing mga polycation, among gi-hypothesize nga ang ilang mga kabtangan sa likido mahimong magkalainlain sa paglabay sa panahon ug sa ingon nag-antos sa lainlaing mga proseso sa LSPT.
Tungod sa hilabihang kahuot nga palibot sulod sa protina nga coacervate ug ang amyloid nga kinaiya sa protina, among naobserbahan ang kinaiya sa coacervate sa paglabay sa panahon aron mahibal-an ang posible nga mga proseso sa LSPT.Gamit ang BF ug CF microscopy (Figure 4), among naobserbahan nga ang αS / Tau441 nag-coacervate sa usa ka dako nga gidak-on sa solusyon, nga nagporma og dagkong mga tinulo nga nagkontak ug nagbasa sa nawong sa ubos sa atabay / slide isip puno nga mga tinulo, sama sa gipaabot (Supplementary Fig 7d);gitawag nato kini nga mga istruktura sa ubos nga porma nga "mga balsa sa protina".Kini nga mga istruktura nagpabilin nga pluwido samtang ilang gihuptan ang abilidad sa pag-fuse (Supplementary Fig. 7b) ug makita sulod sa daghang mga oras human ma-trigger ang LLPS (Fig. 4 ug Supplementary Fig. 7c).Among naobserbahan nga ang proseso sa pag-basa gipaboran sa ibabaw sa hydrophilic kay sa hydrophobic nga mga materyales (Supplementary Fig. 7a), sama sa gipaabot alang sa electrostatic coacervates nga adunay dili balanse nga mga singil ug sa ingon taas nga electrostatic surface potentials.Ilabi na, ang αS / ΔNt-Tau coalescence ug rafting mikunhod pag-ayo, samtang ang αS / pLK condensates mikunhod pag-ayo (Fig. 4).Atol sa mubo nga panahon sa paglumlum, ang αS/pLK droplets nakahimo sa paghiusa ug pag-basa sa hydrophilic nga nawong, apan kini nga proseso dali nga mihunong ug human sa 5 ka oras nga paglumlum, limitado lamang ang mga panghitabo sa coalescence ug walay basa nga naobserbahan.- pagbalhin sa gel-drip.
Representative BF (greyscale panels) ug CF (right panels, AF488-labeled αS in green) sa coacervate samples nga adunay 100 µM αS (1% fluorescent label) sa LLPS buffer sa presensya sa 100 µM Tau441 (top) nga fluorescence nga microscopic nga mga hulagway -Tau (sentro) o 1 mM pLK (ubos) sa lain-laing mga panahon sa paglumlum ug focal gitas-on (z, gilay-on gikan sa ubos sa plate well).Ang mga eksperimento gisubli 4-6 ka beses nga independente sa usag usa nga adunay parehas nga mga resulta.Ang αS/Tau441 coacervates gibasa human sa 24 ka oras, nga nahimong mga balsa nga mas dako pa kay sa hulagway.Ang scale bar alang sa tanang mga hulagway kay 20 µm.
Gipangutana dayon namon kung ang daghang mga pool nga sama sa likido nga protina nga naporma sa αS / Tau441 LLPS magdala sa amyloid aggregation sa bisan unsang mga protina nga gitun-an.Gisundan namo ang pagkahinog sa αS / Tau441 nga mga tinulo sa paglabay sa panahon uban sa WF microscopy ubos sa sama nga mga kondisyon sama sa ibabaw, apan gamit ang 1 μM AF488-label nga αS ug Atto647N-label nga Tau441 (Fig. 5a).Sama sa gipaabut, among naobserbahan ang kompleto nga lokalisasyon sa protina sa tibuuk nga proseso sa pagkahinog.Makaiikag, gikan sa ca.Human sa 5 ka oras, mas grabe nga dili lingin nga mga istruktura ang naobserbahan sa sulod sa mga balsa, nga gitawag namon nga "mga punto", ang uban niini gi-colocalize sa αS, ug ang uban gipadato sa Tau441 (Fig. 5a, puti nga mga pana).Kini nga mga spot kanunay nga naobserbahan sulod sa mga balsa sa mas dako nga gidak-on alang sa αS/ΔNt-Tau kaysa sa αS/ΔNt-Tau.Wala’y lahi nga mga lugar sa mga tinulo sa mga sistema sa pLK ug Tau nga wala’y katakus alang sa pagsagol/pagbasa.Aron masulayan kung kini nga mga mantsa nga adunay αS ug Tau441 mga amyloid-like aggregates, naghimo kami usa ka susama nga eksperimento gamit ang CF microscopy diin ang Tau441 gimarkahan sa Atto647N ug 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) gidugang gikan sa sinugdanan.tina.Bisan tuod ang ThT-staining sa αS / Tau441 nga mga tinulo o mga balsa wala maobserbahan bisan human sa 24 ka oras sa paglumlum (Fig. 5b, ibabaw nga laray-nagpabilin nga mga tinulo sa ibabaw sa mga balsa sa protina), ang ThT-positibong mga istruktura nga adunay Atto647N-Tau441 sulod sa mga balsa huyang kaayo.kini nagsundog sa gidak-on, porma, ug lokasyon sa nauna nga gihulagway nga mga spots (Fig. 5b, tunga-tunga ug ubos nga mga laray), nga nagsugyot nga ang mga spots mahimong katumbas sa amyloid-sama nga mga aggregate nga naporma sa nagka-edad nga fluid coacervates.
WF 25 μM αS sa lain-laing mga panahon sa paglumlum ug focal heights (z, gilay-on gikan sa unbound ubos) sa presensya sa 25 μM Tau441 (1 μM AF488-label nga αS ug Atto647N-label nga Tau441) sa usa ka atabay sa mikroskopyo nga plato nga adunay LLPS buffer) .Unom ka mga eksperimento ang independente nga gisubli nga adunay parehas nga mga resulta.b CF mikroskopiko nga hulagway sa 25 μM αS sa presensya sa 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-label nga Tau441) ug 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Ang gibug-aton nga mga tinulo sa protina ug gideposito nga mga balsa sa protina ug mga spots gipakita sa ibabaw ug tunga nga mga laray, matag usa.Ang ubos nga laray nagpakita sa mga hulagway sa mga balsa ug mga tinulo gikan sa 3 ka independenteng mga replika.Ang puti nga mga pana nagpakita sa ThT-positibo nga mga tuldok sa duha ka mga panel.Ang scale bar alang sa tanang mga hulagway kay 20 µm.
Aron masusi ang dugang nga detalye sa mga pagbag-o sa coacervate protein network sa panahon sa pagbalhin gikan sa likido hangtod sa solid, gigamit namon ang fluorescence lifetime imaging (FLIM) ug Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (Figure 6 ug Supplementary Figures 8 ug 9).Gipanghimatuud namo nga ang coacervate maturation sa layer ngadto sa usa ka mas condensed o bisan solid-like aggregated protein structure mosangpot sa mas duol nga kontak tali sa protina ug sa fluorescent probe nga gilakip niini, nga posibleng makahimo og usa ka quenching effect nga gipakita sa usa ka gipamubo nga probe lifetime (τ) , sama sa gihulagway kaniadto40.,41 ,42.Dugang pa, alang sa doble nga label nga mga sample (AF488 ug Atto647N isip FRET donor ug acceptor dyes, matag usa), kini nga pagkunhod sa τ mahimo usab nga inubanan sa coacervate condensation ug pagtaas sa FRET(E) nga kahusayan sa panahon sa LSPT.Among gimonitor ang raft ug spot formation sa paglabay sa panahon sa LLPS αS/Tau441 ug αS/ΔNt-Tau samples (25 µM sa matag protina sa LLPS buffer nga adunay 1 µM AF488 nga may label nga αS ug/o Atto647N nga may label nga Tau441 o ΔNt-Tau).Among naobserbahan ang usa ka kinatibuk-ang uso nga ang fluorescence nga kinabuhi sa AF488 (τ488) ug Atto647N (τ647N) nga mga pagsusi mikunhod gamay samtang ang mga coacervates nagkahinog (Fig. 6 ug Supplementary Fig. 8c).Makaiikag, kini nga pagbag-o gipauswag pag-ayo alang sa mga tulbok sulod sa mga balsa (Fig. 6c), nga nagpakita nga ang dugang nga pagkondensasyon sa protina nahitabo sa mga tulbok.Sa pagsuporta niini, walay mahinungdanon nga pagbag-o sa fluorescence sa tibuok kinabuhi nga naobserbahan alang sa αS / ΔNt-Tau droplets nga nag-edad alang sa 24 h (Supplementary Fig. 8d), nga nagsugyot nga ang droplet gelation usa ka proseso nga lahi sa spotting ug nga wala giubanan sa mahinungdanon nga molekular reorganization sulod sa coacervates.Kinahanglan nga matikdan nga ang mga tulbok adunay lain-laing mga gidak-on ug variable nga sulod sa αS, ilabi na alang sa αS / Tau441 nga sistema (Supplementary Fig. 8e).Ang pagkunhod sa spot fluorescence lifetime giubanan sa pagtaas sa intensity, ilabi na sa Atto647N nga gimarkahan og Tau441 (Supplementary Fig. 8a), ug mas taas nga FRET efficiencies alang sa αS / Tau441 ug αS / ΔNt-Tau nga mga sistema, nga nagpakita sa dugang nga condensation sa LLPS Lima ka oras. human sa pag-trigger, ang mga protina sa sulod sa static nga elektrisidad nag-condensed.Kung itandi sa αS / ΔNt-Tau, among naobserbahan ang ubos nga τ647N ug medyo mas taas nga τ488 nga mga kantidad sa αS / Tau441 nga mga spot, nga giubanan sa mas ubos ug mas dili managsama nga mga kantidad sa FRET.Posible, kini mahimong may kalabutan sa kamatuoran nga sa αS / Tau441 nga sistema, ang naobserbahan ug gipaabot nga abundance sa αS sa mga aggregates mas heterogenous, kasagaran substoichiometric itandi sa Tau, tungod kay ang Tau441 mismo mahimo usab nga moagi sa LLPS ug aggregation (Supplementary Fig. 8e) .Bisan pa, ang lebel sa droplet coalescence, pagporma sa balsa, ug, hinungdanon, ang pagtipon sa protina sa sulod sa mga coacervate nga sama sa likido mao ang labing kadaghan kung naa ang Tau441 ug αS.
usa ka tibuok kinabuhi nga fluorescence microscopy (FLIM) nga mga hulagway sa αS / Tau441 ug αS / ΔNt-Tau sa 25 μM sa matag protina (1 μM AF488-label nga αS ug 1 μM Atto647N-label nga Tau441 o ΔNt-Tau) sa LLPS buffer.Ang mga kolum nagpakita sa representante nga mga imahe sa mga sample sa LLPS sa lainlaing mga oras sa pagkahinog (30 min, 5 h ug 24 h).Ang pula nga frame nagpakita sa rehiyon nga adunay αS/Tau441 spots.Ang mga gitas-on sa kinabuhi gipakita isip mga bar sa kolor.Scale bar = 20 µm para sa tanang hulagway.b Gi-zoom-in nga FLIM nga hulagway sa pinili nga lugar, gipakita sa pula nga kahon sa panel a.Gipakita ang mga han-ay sa kinabuhi gamit ang parehas nga sukdanan sa kolor sama sa panel a.Scale bar = 5 µm.c Histograms nga nagpakita sa AF488 (gilakip sa αS) o Atto647N (gilakip sa Tau) para sa lain-laing matang sa protina (droplets-D-, raft-R- ug speckle-P) nga giila sa FLIM nga mga hulagway nga natala para sa αS-) timing distributions tibuok kinabuhi sa Tau441 ug αS/ΔNt-Tau coacervate samples (N = 17-32 ROI para sa D, 29-44 ROI para sa R, ug 21-51 ROI para sa puntos).Ang mean ug median nga mga kantidad gipakita ingon nga mga yellow square ug itom nga mga linya sa sulod sa mga kahon, matag usa.Ang ubos ug taas nga mga utlanan sa kahon nagrepresentar sa una ug ikatulo nga quartile, matag usa, ug ang minimum ug maximum nga mga kantidad sulod sa 1.5-fold interquartile range (IQR) gipakita isip whiskers.Ang mga outlier gipakita nga itom nga diamante.Ang kahulogan sa istatistika tali sa mga pares sa mga pag-apod-apod gitino gamit ang duha ka sample nga t-test, nga nagtuo nga dili patas nga mga kalainan.Ang duha ka ikog nga t-test nga p-value gipakita nga adunay mga asterisk para sa matag parisan sa gitandi nga datos (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns Nagpakita sa pagpasagad (p-value > 0.05).Ang eksaktong p value gihatag sa Supplementary Table 1, ug ang orihinal nga data gipresentar isip hilaw nga data files.
Aron sa dugang nga pagpakita sa amyloid-sama nga kinaiya sa speckles / aggregates, kami pagtratar sa unstained coacervate samples alang sa 24 oras uban sa taas nga konsentrasyon sa (1 M) NaCl, nga miresulta sa pagbulag sa mga aggregates gikan sa protina coacervates.Sa diha nga ang nahilit nga mga aggregate (ie, usa ka dispersed nga solusyon sa mga aggregates) naobserbahan gamit ang atomic force microscopy (AFM), among naobserbahan ang usa ka kasagaran nga spherical morphology nga adunay regular nga gitas-on nga mga 15 nm, nga lagmit nga mag-associate ubos sa mga kondisyon sa taas nga konsentrasyon sa asin, susama sa ang kinaiya sa tipikal nga amyloid fibrils tungod sa kusog nga hydrophobic nga epekto sa ibabaw (timan-i nga ang fibrils kasagaran adunay gitas-on nga ~ 10 nm) (Supplementary Fig. 10a).Makapainteres, kung ang mga nahilit nga mga aggregate gilusok sa ThT sa usa ka standard nga ThT fluorescence assay, among nakita ang usa ka dramatikong pagtaas sa ThT fluorescence quantum yield, nga ikatandi sa naobserbahan sa dihang ang tina gilumlom sa tipikal nga αS amyloid fibrils (Supplementary Fig. 10b), nagsugyot nga ang mga coacervate aggregates adunay mga istruktura nga sama sa amyloid..Sa pagkatinuod, ang mga aggregate tolerant sa taas nga konsentrasyon sa asin apan sensitibo sa 4 M guanidine chloride (GdnHCl), sama sa tipikal nga amyloid fibrils (Supplementary Fig. 10c).
Sunod, among gisusi ang komposisyon sa mga aggregates gamit ang single molecule fluorescence, specific fluorescence correlation/cross-correlation spectroscopy (FCS/FCCS), ug burst analysis sa two-color coincidence detection (TCCD).Sa kini nga katuyoan, gilain namon ang mga aggregate nga naporma pagkahuman sa 24 oras nga paglumlum sa 100 μl nga mga sample sa LLPS nga adunay sulud nga αS ug Tau441 (parehong 25 μM) kauban ang 1 μM AF488 nga adunay label nga αS ug 1 μM Atto647N nga adunay label nga Tau441.Dilute ang resulta nga dispersed aggregate solution ngadto sa monomolecular state gamit ang parehas nga PEG-free buffer ug 1 M NaCl (sama nga buffer nga gigamit sa pagbulag sa mga aggregate gikan sa coacervate) aron mapugngan ang bisan unsang posibleng electrostatic interaksyon tali sa LLPS ug protina.Usa ka pananglitan sa time trajectory sa usa ka molekula makita sa Fig. 7a.Ang pag-analisa sa FCCS / FCS (cross-correlation, CC ug autocorrelation, AC) nagpakita nga ang mga aggregate nga adunay αS ug tau abunda sa mga sample (tan-awa ang CC curve sa Fig. 7b, left panel), ug ang sobra sa residual monomeric protein mitungha isip usa ka resulta sa proseso sa dilution (tan-awa ang AC curves sa Figure 7b, left panel).Ang mga eksperimento sa pagkontrol nga gihimo ubos sa sama nga mga kondisyon sa solusyon gamit ang mga sample nga adunay sulod lamang nga monomeric nga mga protina nagpakita nga walay CC curves, ug ang AC curves mohaum pag-ayo sa one-component diffusion model (Eq. 4), diin ang monomeric proteins adunay gipaabot nga diffusion coefficients (Fig. 7b ), tuo nga panel).Ang diffusion coefficient sa mga aggregated nga partikulo dili mubu sa 1 µm2/s, ug ang sa monomeric nga protina maoy mga 1 µm2/s.50–100 µm/s;ang mga kantidad parehas sa nauna nga gipatik nga mga kantidad alang sa sonicated αS amyloid fibrils ug monomeric αS nga gilain ubos sa parehas nga kondisyon sa solusyon44.Sa dihang among gi-analisa ang mga aggregate nga adunay TCCD explosion analysis (Fig. 7c, top panel), among nakita nga sa matag nahilit nga aggregate (αS / Tau heteroaggregate), mga 60% sa mga nakit-an nga aggregate adunay duha ka αS ug tau, mga 30% ang anaa lamang tau, mga 10% αS lang.Ang stoichiometric analysis sa αS / Tau heteroaggregates nagpakita nga kadaghanan sa mga heteroaggregate gipadato sa tau (stoichiometry ubos sa 0.5, ang kasagaran nga gidaghanon sa tau molekula kada aggregate mao ang 4 ka beses nga labaw pa kay sa αS molekula), nga nahiuyon sa atong trabaho nga naobserbahan sa FLIM in situ. mga eksperimento..Gipakita sa pag-analisa sa FRET nga kini nga mga aggregate adunay parehas nga mga protina, bisan kung ang tinuud nga mga kantidad sa FRET sa kini nga kaso dili hinungdanon, tungod kay ang pag-apod-apod sa mga fluorophores sa matag aggregate random tungod sa sobra nga wala’y label nga protina nga gigamit sa eksperimento.Makaiikag, kung gihimo namon ang parehas nga pag-analisar gamit ang 45,46 nga hamtong nga amyloid aggregation-deficient Tau nga variant (tan-awa ang Supplementary Fig. 11a, b), namatikdan namon nga bisan kung parehas ang αS electrostatic aggregation (Supplementary Fig. 11c, d), ang abilidad sa pagporma og mga aggregate sulod sa coacervate mikunhod pag-ayo ug ang FLIM nakamatikod sa daghang mga spots sa in situ nga mga eksperimento, ug ang huyang nga cross-correlation curves naobserbahan alang sa nahilit nga aggregate sample.Bisan pa, alang sa usa ka gamay nga gidaghanon sa mga nakit-an nga mga aggregate (usa ra sa ikanapulo nga bahin sa Tau441), among naobserbahan nga ang matag aggregate gipadato sa αS kaysa sa kini nga variant sa Tau, nga adunay gibana-bana nga 50% sa mga nakit-an nga aggregate nga adunay sulud nga molekula nga αS, ug ang αS heterogenous nga sobra. .aggregates (tan-awa ang Supplementary Fig. 11e), sukwahi sa heterogeneous aggregates nga namugna sa Tau441 (Fig. 6f).Ang mga resulta sa kini nga mga eksperimento nagpakita nga bisan kung ang αS mismo makahimo sa pagtipon sa tau sulod sa coacervate, ang tau nucleation mas paborable ubos niini nga mga kondisyon, ug ang mga resulta nga sama sa amyloid nga mga aggregate makahimo sa paglihok isip usa ka porma sa αS ug tau.Bisan pa, sa higayon nga maporma ang usa ka punoan nga puno sa tau, ang mga heterotypic nga interaksyon tali sa αS ug tau gipaboran sa mga aggregate kaysa sa homotypic nga interaksyon tali sa mga molekula sa tau;naobserbahan usab namo ang mga network sa protina sa liquid αS/tau coacervates.
usa ka Representante nga fluorescence temporal nga pagsubay sa usa ka molekula sa nahilit nga mga aggregate nga naporma sa αS/Tau441 electrostatic coacervates.Ang mga pagbuto nga katumbas sa mga coaggregate sa αS / Tau441 (mga pagbuto sa ibabaw sa gipakita nga threshold) naobserbahan sa tulo nga mga kanal sa pag-ila (AF488 ug Atto647N nga gipagawas pagkahuman sa direkta nga pagpukaw, asul ug pula nga mga linya, Atto647N nga pagbuga pagkahuman sa dili direkta nga pagpukaw), FRET, violet nga linya).b Pagtuki sa FCS/FCCS sa usa ka sample sa nahilit nga αS/Tau441 aggregates nga nakuha gikan sa LLPS (wala nga panel).Ang Autocorrelation (AC) nga mga kurba para sa AF488 ug Atto647N gipakita sa asul ug pula, matag usa, ug ang cross-correlation (CC) nga mga kurba nga may kalabotan sa mga aggregate nga adunay duha ka tina gipakita sa purpura.Ang AC curves nagpakita sa presensya sa gimarkahan nga monomeric ug aggregated protein species, samtang ang CC curves nagpakita lamang sa diffusion sa double-labeled aggregates.Ang parehas nga pag-analisar, apan ubos sa parehas nga mga kondisyon sa solusyon sama sa nahilit nga mga lugar, ang mga sample nga adunay sulud nga monomeric αS ug Tau441 gipakita ingon mga kontrol sa tuo nga panel.c Fluorescence flash analysis sa usa ka molekula sa nahilit nga mga aggregate nga naporma sa αS/Tau441 electrostatic coacervates.Ang impormasyon alang sa matag aggregate nga makita sa upat ka lain-laing mga pag-usab (N = 152) giplano batok sa ilang stoichiometry, S values, ug FRET efficiency (top panel, color bar nagpakita sa panghitabo).Tulo ka matang sa mga aggregate mahimong mailhan: -αS-lamang nga mga aggregate nga adunay S~1 ug FRET~0, Tau-only aggregates nga adunay S~0 ug FRET~1, ug heterogenous nga Tau/αS aggregates nga adunay intermediate S ug FRET Mga banabana sa kantidad sa duha ka marker nga mga protina nga nakita sa matag heterogeneous aggregate (N = 100) gipakita sa ubos nga panel (ang color scale nagpakita sa panghitabo).Ang hilaw nga datos gihatag sa porma sa hilaw nga mga file sa datos.
Ang pagkahinog o pagkatigulang sa liquid protein condensates ngadto sa gel-like o solid nga mga istruktura sa paglabay sa panahon gikataho nga nalangkit sa daghang physiological functions sa condensate47 ingon man sa sakit, isip abnormal nga proseso nga nag-una sa amyloid aggregation 7, 48, 49. Dinhi atong gitun-an ang bahin sa panagbulag ug kinaiya sa detalye.Ang LSPT αS sa presensya sa random polycations sa usa ka kontrolado nga palibot sa ubos nga micromolar nga konsentrasyon ug physiologically may kalabutan nga mga kondisyon (timan-i nga ang kalkulado nga physiological nga konsentrasyon sa αS mao ang> 1 µM50), nga nagsunod sa tipikal nga thermodynamically driven nga kinaiya sa LPS.Nakita namon nga ang αS, nga adunay sulud nga negatibo nga gikargahan nga C-terminal nga rehiyon sa physiological pH, makahimo sa pagporma sa mga tinulo nga puno sa protina sa tubigon nga solusyon pinaagi sa LLPS sa presensya sa mga kaayo nga cationic disordered peptides sama sa pLK o Tau pinaagi sa proseso sa electrostatic. komplikado nga condensation sa presensya sa aggregation macromolecules.Kini nga proseso mahimong adunay kalabutan nga mga epekto sa cellular nga palibot diin ang αS nakatagbo sa lainlaing mga molekula nga polycationic nga may kalabutan sa panagsama nga adunay kalabotan sa sakit pareho sa vitro ug sa vivo51,52,53,54.
Sa daghang mga pagtuon, ang mga dinamikong protina sa sulod sa mga tinulo gikonsiderar nga usa sa mga hinungdan nga hinungdan nga nagtino sa proseso sa pagkahinog55,56.Sa electrostatic αS coacervates sa polycations, ang proseso sa pagkahinog dayag nga nagdepende sa kalig-on sa mga interaksyon sa polycations, ang valence, ug ang multiplicity niini nga mga interaksyon.Ang teorya sa balanse nagsugyot nga ang usa ka balanse nga talan-awon sa duha ka likido nga estado mao ang presensya sa usa ka dako nga tinulo nga dato sa biopolymers nga nagmaneho sa LLPS57,58.Ang pagtubo sa tinulo mahimong makab-ot pinaagi sa Ostwald maturation59, coalescence60 o pagkonsumo sa libre nga monomer sa dispersed phase61.Alang sa αS ug Tau441, ΔNt-Tau o pLK, kadaghanan sa protina gikonsentrar sa condensate ubos sa mga kondisyon nga gigamit niini nga pagtuon.Bisan pa, samtang ang bug-os nga gidak-on nga mga tinulo nga tau nahugpong sa paspas nga pag-uga sa ibabaw, ang droplet coalescence ug basa lisud alang sa ΔNt-Tau ug pLK, nga nagsugyot sa usa ka paspas nga pagkawala sa mga kabtangan sa likido niining duha nga mga sistema.Sumala sa among pag-analisa sa FLIM-FRET, ang mga tigulang nga pLK ug ΔNt-Tau nga mga tinulo nagpakita sa parehas nga lebel sa panagsama sa protina (parehas nga fluorescence nga kinabuhi) sama sa orihinal nga mga tinulo, nga nagsugyot nga ang orihinal nga network sa protina gipadayon, bisan kung labi ka estrikto.
Gipangatarungan namo ang among mga resulta sa eksperimento sa mosunod nga modelo (Figure 8).Ang una nga temporaryo nga naporma nga mga tinulo sagad nga mga network sa protina nga wala’y bayad sa electrostatic, ug sa ingon adunay mga lugar nga dili balanse sa bayad, labi na sa interface sa tinulo, nga miresulta sa mga tinulo nga adunay taas nga potensyal sa electrostatic sa nawong.Aron mabayran ang bayad (usa ka panghitabo nga kasagarang gitawag nga valence depletion) ug maminusan ang potensyal sa nawong sa mga tinulo, ang mga tinulo mahimong maglakip sa mga bag-ong polypeptides gikan sa dilute nga hugna, pag-organisar pag-usab sa mga network sa protina aron ma-optimize ang mga interaksyon sa bayad, ug makig-uban sa ubang mga tinulo.nga adunay mga ibabaw (wetting).Ang mga tinulo sa αS / pLK, tungod sa ilang mas simple nga network sa protina (mga heterotypic lamang nga interaksyon tali sa αS ug pLK) ug mas dako nga kalambigitan alang sa mga interaksyon sa protina-protina, daw makahimo sa pagbalanse sa bayad sa condensate nga mas paspas;Sa tinuud, nakita namon ang mas paspas nga kinetics sa protina sa una nga naporma nga αS / pLK coacervates kaysa sa αS / Tau.Pagkahuman sa pagkunhod sa valence, ang mga interaksyon mahimong dili kaayo ephemeral ug ang mga tinulo mawad-an sa ilang mga likido nga kabtangan ug nahimo nga sama sa gel, dili masunog nga mga tinulo nga adunay gamay nga electrostatic nga potensyal sa nawong (ug busa dili mabasa ang nawong).Sa kasukwahi, ang αS/Tau droplets dili kaayo episyente sa pag-optimize sa droplet charge balance tungod sa mas komplikado nga mga network sa protina (uban ang homotypic ug heterotypic nga mga interaksyon) ug ang mas huyang nga kinaiya sa mga interaksyon sa protina.Nagresulta kini sa mga tinulo nga nagpabilin nga likido nga pamatasan sa taas nga mga yugto sa panahon ug nagpakita sa usa ka taas nga electrostatic nga potensyal sa nawong nga lagmit nga maminusan pinaagi sa paghiusa ug pagtubo (sa ingon gipaminusan ang sulud sa sulud / volume nga ratio sa mga tinulo) ug pinaagi sa pagbasa sa hydrophilic surface chem.Naghimo kini og daghang mga librarya nga nagkonsentrar sa protina nga nagpabilin nga mga kabtangan sa likido tungod kay ang mga interaksyon nagpabilin nga lumalabay tungod sa kanunay nga pagpangita alang sa pag-optimize sa bayad sa network sa protina.Makapainteres, ang N-terminally truncated nga mga porma sa Tau, lakip ang pipila ka natural nga mga isoform62, nagpakita sa intermediate nga kinaiya, uban sa pipila nga nag-coacervate sa pagkatigulang uban sa αS ngadto sa dugay nga kinabuhi nga gel-like droplets, samtang ang uban nausab ngadto sa dagkong liquid condensates.Kini nga duality sa pagkahinog sa αS electrostatic coacervates nahiuyon sa bag-o nga LLPS theoretical ug experimental nga mga pagtuon nga nagpaila sa usa ka correlation tali sa valence depletion ug electrostatic sieving sa condensates isip usa ka yawe sa pagkontrolar sa condensate size ug fluid properties.Mekanismo 58.61.
Kini nga laraw nagpakita sa putative amyloid aggregation pathway alang sa αS ug Tau441 pinaagi sa LLPS ug LSPT.Uban sa dugang nga anion-rich (pula) ug cation-rich (asul) nga mga rehiyon, ang αS ug tau electrostatic coacervates nga adunay makatagbaw nga valence adunay ubos nga enerhiya sa nawong ug busa dili kaayo coalescence, nga miresulta sa paspas nga pagkatigulang sa droplet.Nakab-ot ang usa ka lig-on nga non-agglomerated gel state..Kini nga sitwasyon maayo kaayo sa kaso sa αS / pLK nga sistema tungod sa mas taas nga affinity ug mas simple nga network sa interaksyon sa protina-pares, nga nagtugot alang sa paspas nga pagbalhin sa gel.Sa kasukwahi, ang mga tinulo nga adunay dili maayo nga valence ug, busa, ang mga rehiyon nga gikargahan sa protina nga magamit alang sa interaksyon, nagpasayon ​​sa coacervate sa pag-fuse ug basa sa hydrophilic nga nawong aron makunhuran ang taas nga enerhiya sa nawong niini.Kini nga sitwasyon mas maayo alang sa αS/Tau441 coacervates, nga adunay multivalent complex network nga naglangkob sa huyang nga Tau-Tau ug αS-Tau nga mga interaksyon.Sa baylo, ang mas dagkong mga coacervate mas dali nga magpabilin sa ilang mga kabtangan nga sama sa likido, nga magtugot sa ubang mga interaksyon sa protina-sa-protina nga mahitabo.Sa kadugayan, ang amyloid heterogeneous aggregates nga adunay parehas nga αS ug tau nga porma sa sulod sa coacervate fluid, nga mahimong may kalabutan sa mga nakit-an sa mga inklusibo nga lawas, nga mga timaan sa mga sakit nga neurodegenerative.
Ang dagkong mga istruktura nga sama sa pluwido nga naporma sa panahon sa pagkahinog sa αS / Tau441 nga adunay usa ka kaayo nga congested apan dinamikong protina nga palibot ug, sa usa ka gamay nga gidak-on, ang αS / ΔNt-Tau coacervates mga sulundon nga mga reservoir alang sa nucleation sa protina aggregation.Naobserbahan gyud namo ang pagkaporma sa solid nga mga aggregate sa protina niining matang sa mga protina nga coacervates, nga sagad adunay αS ug tau.Gipakita namo nga kini nga mga heteroaggregate gipalig-on sa mga non-electrostatic nga mga interaksyon, makahimo sa pagbugkos sa amyloid-specific ThT tina sa samang paagi sama sa tipikal nga amyloid fibrils, ug sa pagkatinuod adunay susama nga pagsukol sa lainlaing mga impluwensya.Ang mga aggregate sa αS/tau nga naporma sa LLPS gipakita nga adunay mga kabtangan nga sama sa amyloid.Sa tinuud, ang hamtong nga variant sa Tau nga kulang sa amyloid aggregation grabe nga nadaot sa pagporma niining mga heterogenous αS aggregates sulod sa liquid electrostatic coacervate.Ang pagporma sa αS / Tau441 nga mga aggregate naobserbahan lamang sa sulod sa mga coacervates, nga nagpabilin nga likido nga sama sa mga kabtangan, ug dili gayud, kung ang mga coacervates / droplets wala makaabot sa gel state.Sa ulahing kaso, ang dugang nga kalig-on sa electrostatic interaksyon ug, ingon sa usa ka resulta, ang rigidity sa protina network makapugong sa gikinahanglan nga conformational rearrangements sa mga protina sa pagtukod sa bag-ong protina interaksyon nga gikinahanglan alang sa amyloid nucleation.Bisan pa, mahimo kini nga makab-ot sa labi ka flexible, sama sa likido nga mga coacervate, nga sa baylo mas lagmit nga magpabilin nga likido samtang kini nagdugang sa gidak-on.
Ang kamatuoran nga ang pagporma sa mga aggregate sulod sa condensed phase mas maayo sa dagkong αS/Tau condensates kay sa gagmay nga mga tinulo nga paspas nga gel, nagpasiugda sa kalambigitan sa pag-ila sa mga hinungdan nga nagkontrol sa droplet coalescence.Busa, dili lamang adunay kalagmitan sa pagbulag sa hugna, apan ang gidak-on sa condensate kinahanglan nga kontrolon alang sa husto nga paglihok ingon man sa paglikay sa sakit58,61.Gipasiugda usab sa among mga resulta ang kamahinungdanon sa balanse tali sa LLPS ug LSPT alang sa sistema sa αS / Tau.Samtang ang pagporma sa droplet mahimong mapanalipdan batok sa amyloid aggregation pinaagi sa pagkunhod sa gidaghanon sa mga monomer sa protina nga magamit sa ilawom sa mga kondisyon sa saturation, ingon nga gisugyot sa ubang mga sistema63,64, ang droplet fusion sa taas nga lebel sa droplet mahimong mosangput sa internal nga panagsama sa protina pinaagi sa hinay nga pagbag-o sa conformational.mga network sa protina..
Sa kinatibuk-an, ang among datos kusganong nagpasiugda sa kalabutan sa nagkahiusang valence ug natagbaw / dili kontento nga mga interaksyon sa mga drop network sa konteksto sa LSPT.Sa partikular, gipakita namo nga ang bug-os nga gitas-on nga αS / Tau441 condensates makahimo sa episyente nga pag-fuse ug nucleate aron maporma ang amyloid-like heteroaggregates nga naglakip sa duha ka protina ug nagsugyot og mekanismo sa molekula base sa among mga resulta sa eksperimento.Ang co-aggregation sa duha ka protina sa αS / Tau fluid coacervate nga among gitaho dinhi mahimo nga adunay kalabutan sa co-localization sa duha ka protina sa mga inklusyon, nga mga timaan sa sakit, ug mahimong makatampo sa pagsabut sa relasyon tali sa LLPS ug amyloid aggregation, nga naghatag sa dalan alang sa taas nga bayad nga IDP sa neurodegeneration.
Ang Monomeric WT-αS, cysteine ​​​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) ug ΔCt-αS nga mga variant (Δ101-140) gipahayag sa E. coli ug giputli sama sa gihulagway kaniadto.Ang 5 mM DTT gilakip sa tanan nga mga lakang sa pagputli sa αS cysteine ​​​​mutants aron mapugngan ang pagporma sa disulfide bond.Tau441 isoform (plasmid nakuha gikan sa Addgene #16316), ΔNt-Tau variant (Δ1-150, nakuha pinaagi sa cloning IVA uban sa primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ug AggDef-Tau variant sa EGC275 nga kultura (1ΔTC5-Tau) mitubo ngadto sa OD600 = 0.6-0.7 sa 37 ° C ug 180 rpm, ug ang ekspresyon naaghat sa IPTG sulod sa 3 ka oras sa 37 ° C.Pag-ani sa mga selula sa 11,500 xg sulod sa 15 min sa 4 °C ug hugasi gamit ang saline buffer nga adunay 150 mM NaCl.I-resuspend ang pellet sa lysis buffer (20 ml kada 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100).Ang sonication nga lakang gihimo sa yelo nga adunay amplitude nga 80% alang sa 10 ka mga pulso (1 min sa, 1 min off).Dili molapas sa 60 ml sa usa ka ultrasound.Ang E. coli lysates gipainit sa 95 ° C. sulod sa 20 minutos, dayon gipabugnaw sa yelo ug gi-centrifuge sa 127,000 × g sulod sa 40 minutos.Ang giklaro nga supernatant gipadapat sa usa ka 3.5 kDa lamad (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) ug gi-dialyze batok sa 4 L nga dialysis buffer (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2mM , PMSF 0.1 mM) sulod sa 10 ka oras.Ang usa ka 5 ml cation exchange column (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) gi-equilibrate sa equilibration buffer (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Ang tau lysate gisala pinaagi sa usa ka 0.22 μm PVDF filter ug gi-injected ngadto sa column sa usa ka flow rate nga 1 ml/min.Ang elution gihimo sa hinay-hinay, ang tau gi-eluted sa 15-30% elution buffer (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Ang mga tipik gisusi sa SDS-PAGE, ug ang bisan unsang mga fraction nga adunay usa ka banda nga adunay gipaabot nga molekular nga gibug-aton sa tau gikonsentrar gamit ang 10 kDa centrifuge filter ug gipulihan sa usa ka buffer nga adunay 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ug DTT 2 mM alang sa ang katapusan nga konsentrasyon sa protina mao ang 100 μM.Ang solusyon sa protina gipaagi sa usa ka 0.22 μm PVDF filter, dali nga nagyelo ug gitipigan sa -80 ° C.Ang Protein K18 malulotong gihatag ni Prof. Alberto Boffi.Ang kaputli sa pagpangandam kay> 95% ingon nga gikumpirma sa SDS-PAGE ug MALDI-TOF/TOF.Ang lainlaing mga cysteinees gimarkahan sa kemikal nga adunay AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) o TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).gikumpirma sa absorbance ug MALDI-TOF/TOF.Ang Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ug K18 gimarkahan og lumad nga cysteine ​​​​resdues sa mga posisyon 191 ug 322 gamit ang Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) nga nagsunod sa samang pamaagi.Ang net charge kada residue nga mapa para sa αS ug Tau441 namugna gamit ang CIDER66.
Solid poly-L-lysine (pLK DP 90-110 sumala sa NMR gikan sa supplier, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) natunaw sa 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 ngadto sa 10 mM konsentrasyon, proseso sonicated alang sa 5 minuto sa usa ka ultrasonic nga tubig nga kaligoanan ug tipigi sa -20°C.Ang PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ug FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) kay matunaw sa tubig ug kaylap nga giapod-apod sa LLPS buffer.Ang dialysis nagtangtang sa kontaminado nga mga asin.Dayon sila gisala pinaagi sa usa ka filter sa syringe nga adunay gidak-on nga pore nga 0.22 μm, ug ang ilang mga konsentrasyon gikalkula gamit ang refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Ang mga sample sa LLPS giandam sa temperatura sa lawak sa mosunod nga han-ay: buffer ug extrusion gisagol ug 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) ug usa ka sinagol nga 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Dayon ang αS ug fused polycations (mga opsyon pLK o Tau) idugang.Para sa thioflavin-T time series nga mga eksperimento (ThT, Carbosynth, Compton, UK), gamita ang kinatibuk-ang konsentrasyon sa ThT nga mahimong katunga sa konsentrasyon sa αS.Hinay-hinay apan hingpit nga sagola ang mga sample aron masiguro nga sila homogenous.Ang konsentrasyon sa matag sangkap lainlain gikan sa eksperimento hangtod sa eksperimento, ingon nga gihulagway sa seksyon sa Mga Resulta.Ang Azide gigamit sa usa ka konsentrasyon nga 0.02% (w/v) kung ang gidugayon sa eksperimento molapas sa 4 ka oras.Para sa tanan nga pag-analisa gamit ang LLPS samples, tugoti ang mixture nga mag-equilibrate sulod sa 5 minutos sa dili pa ang pag-analisa.Para sa light scattering analysis, 150 µl sa sample ang gikarga sa non-binding 96-well microplates (µClear®, black, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) ug gitabonan sa adhesive film.Ang mga LLP gimonitor pinaagi sa pagsukod sa absorbance sa 350 nm sa sentro sa solusyon sa usa ka CLARIOstar plate reader (BMG Labtech, Ortenberg, Germany).Ang mga eksperimento gihimo sa triplicate sa 25 ° C, ug ang mga kasaypanan gikalkula isip standard deviation gikan sa mean.Ang dilute phase gi-quantified pinaagi sa sample centrifugation ug SDS-PAGE gel analysis, ug ang αS fraction sa dilute ug concentrated nga mga hugna gi-quantified sa lain-laing mga solusyon sa LLPS.Usa ka 100 μl LLPS sample nga adunay 1 μM AF488-labeled αS giandam pinaagi sa bug-os nga pagsagol nga gisundan sa centrifugation sa 9600 × g sulod sa 30 minutos, human niini ang precipitate kasagarang makita.Ang kinatas-ang 50 μl sa supernatant gigamit alang sa pag-ihap sa protina gamit ang SDS-PAGE gel.Gi-scan ang mga gel gamit ang mga filter sa AF488 gamit ang ChemiDoc gel imaging system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) o gimantsa sa Coomassie stain ug gitan-aw sa angay nga mga filter.Ang resulta nga mga banda gisusi gamit ang ImageJ version 1.53i (National Institutes of Health, USA).Ang mga eksperimento gihimo nga doble sa duha ka lainlaing mga eksperimento nga adunay parehas nga mga sangputanan.
Kasagaran, ang 150 μl nga mga sample gipadapat sa dili pagbugkos nga 96-well microplates ug makita sa temperatura sa kwarto sa usa ka Leica DMI6000B inverted microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).Alang sa mga eksperimento sa lugar, gigamit usab ang µ-Slide Angiogenesis plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) o 96-well polystyrene microplate (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Ang EL6000 halogen o mercury metal halide nga mga lampara gigamit isip mga tinubdan sa kahayag (alang sa BF/DIC ug WF imaging, matag usa).Para sa WF microscopy, usa ka 40x magnification air objective (Leica Microsystems, Germany) ang gigamit aron ipunting ang kahayag sa sample ug kolektahon kini.Para sa AF488 ug ThT nga mga sampol nga may label, filter nga excitation ug emission nga adunay standard GFP filter sets, excitation ug emission bandpass filters, matag usa, 460-500 nm ug 512-542 nm bandpass filters, ug 495 nm dichroic mirror.Alang sa mga sampol nga gimarkahan sa Atto647N, usa ka sumbanan nga set sa mga pagsala sa Cy5 nga adunay mga pagsala sa pagpukaw ug pagbuga sa bandpass nga 628-40 nm ug 692-40 nm, matag usa, ug usa ka 660 nm dichroic nga salamin ang gigamit.Para sa BF ug DIC microscopy, gamita ang parehas nga gipabanaag nga katuyoan sa pagkolekta sa kahayag.Ang nakolekta nga kahayag girekord sa usa ka Leica DFC7000 CCD camera (Leica Microsystems, Germany).Ang oras sa pagkaladlad mao ang 50 ms alang sa BF ug DIC microscopy imaging ug 20-100 ms alang sa WF microscopy imaging.Alang sa pagtandi, ang oras sa pagkaladlad alang sa tanan nga mga eksperimento sa ThT mao ang 100 ms.Gipahigayon ang mga eksperimento sa time-lapse aron mahanduraw ang droplet coalescence, nga adunay mga imahe nga gikolekta matag 100 ms sulod sa pipila ka minuto.Ang ImageJ (NIH, USA) gigamit alang sa pagtuki sa imahe.Ang mga eksperimento gihimo sa triplicate nga adunay parehas nga mga resulta.
Para sa mga eksperimento sa colocalization, FRAP ug 3D reconstruction, nakuha ang mga hulagway sa Zeiss LSM 880 inverted confocal microscope gamit ang ZEN 2 blue nga edisyon (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).Ang mga sample sa 50 µl gipadapat sa µ-Slide Angiogenesis Petri dishes (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germany), gitambalan sa usa ka hydrophilic polymer (ibiTreat) ug gitaod sa usa ka 63 × oil immersion nga tumong (Plan-Apochromat 63 ×/NA 1.4 Oil) sa DIC).Nakuha ang mga imahe gamit ang 458 nm, 488 nm, ug 633 nm argon laser nga mga linya nga adunay resolusyon nga 0.26 µm/pixel ug oras sa pagkaladlad nga 8 µs/pixel para sa excitation ug emission detection windows sa 470-600 nm, 493-628 nm, ug 638–755 nm gigamit sa paghanduraw sa ThT, AF488 ug Atto647N, matag usa.Alang sa mga eksperimento sa FRAP, ang time-lapse nga litrato sa matag sample natala sa 1 frame matag segundo.Ang mga eksperimento gihimo sa triplicate sa temperatura sa kwarto nga adunay parehas nga mga resulta.Ang tanan nga mga hulagway gisusi gamit ang Zen 2 blue edition software (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).Ang mga kurba sa FRAP gi-normalize, giplano ug gipaangay sa intensity/time data nga gikuha gikan sa mga hulagway gamit ang Zen 2 gamit ang OriginPro 9.1.Ang mga kurba sa pagbawi gisangkapan sa usa ka mono-exponential nga modelo aron i-account ang molekular nga pagsabwag nga adunay dugang nga exponential nga termino aron maasoy ang epekto sa pagpaputi sa pagkuha.Dayon among gikalkulo ang D gamit ang nominal bleaching radius ug ang kaniadto gitino nga recovery half-life sama sa equation sa Kang et al.535 gipakita.
Ang mga single cysteine ​​​​variant sa αS gi-synthesize sa 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) sa mga posisyon 24 (TEMPOL-24-αS) ug 122 (TEMPOL-122-αS), matag usa.Spin Labeling Alang sa mga eksperimento sa EPR, ang konsentrasyon sa αS gibutang sa 100 μM ug ang konsentrasyon sa PEG mao ang 15% (w / v).Alang sa lainlaing mga kondisyon sa panagsama, ang ratio sa αS:pLK mao ang 1:10, samtang ang mga ratios sa αS:ΔNt-Tau ug αS:Tau441 gipadayon sa 1:1.Alang sa pagbugkos nga mga eksperimento sa titration kung wala ang paghuot, ang TEMPOL-122-αS gipadayon sa 50 μM ug ang mga polycation gi-titrat sa pagtaas sa mga konsentrasyon, giandam ang matag kondisyon nga gilain.Ang mga pagsukod sa CW-EPR gihimo gamit ang Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer nga adunay gamit nga Bruker ER4118 SPT-N1 resonator nga naglihok sa usa ka frequency sa microwave (SHF) nga ~ 9.7 GHz.Ang temperatura gibutang sa 25 ° C ug gikontrol sa usa ka liquid nitrogen cryostat.Ang spectra nakuha ubos sa unsaturated nga mga kondisyon sa usa ka MW nga gahum sa 4 mW, usa ka modulation amplitude sa 0.1 mT, ug usa ka modulation frequency sa 100 kHz.Gi-normalize ang spectral intensities aron malikayan ang mga kalainan sa mga konsentrasyon sa spin tali sa mga sample ug posible nga pagkunhod sa spin tungod sa nahabilin nga mga konsentrasyon sa pagkunhod sa mga ahente sa mga sample nga adunay Tau441 o ΔNt-Tau (naa sa orihinal nga mga solusyon sa protina).Ang gihatag nga mga kantidad sa g nakuha isip resulta sa EPR spectral modeling nga gihimo gamit ang Easyspin software (v. 6.0.0-dev.34) nga gipatuman sa Matlab®67.Usa/duha ka component isotropic nga mga modelo ang gigamit sa pagmodelo sa datos.Pagkahuman sa pag-normalize sa tanan nga mga signal, ang mga nahabilin gikalkula pinaagi sa pagkunhod sa matag simulation gikan sa katugbang nga spectrum sa eksperimento.Para sa binding titration analysis, ang relatibong intensity sa ikatulo nga banda ngadto sa ikaduhang banda sa normalized EPR spectrum (IIII/III) gigamit sa pagmonitor sa pagbugkos sa polycations sa αS.Aron mabanabana ang dissociation constant (Kd), ang resulta nga kurba gipaangay sa usa ka gibanabana nga modelo nga nagtuo nga n managsama ug independente nga nagbugkos nga mga site.
Ang mga eksperimento sa NMR spectroscopy gihimo gamit ang Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spectrometer nga adunay cryoprobe ug Z-gradient.Ang tanan nga mga eksperimento gihimo gamit ang 130-207 µM αS ug katugbang nga αS / ΔNt-Tau ug pLK nga katumbas sa 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ug gihimo sa 15 ° C.Aron ma-monitor ang LPS pinaagi sa NMR, ang 10% nga PEG gidugang sa mga pre-mixed sample.Ang chemical shift perturbation plot (Fig. 1b) nagpakita sa kasagaran nga 1H ug 15N nga kemikal nga pagbalhin.Ang αS 2D1H-15N HSQC spectra gi-assign base sa miaging assignment (BMRB entry #25227) ug gikumpirma pinaagi sa pagrekord ug pag-analisar sa 3D spectra sa HNCA, HNCO ug CBCAcoNH.Ang 13Cα ug 13Cβ nga mga pagbalhin sa kemikal gikalkulo sa presensya sa ΔNt-Tau o pLK aron masukod ang posible nga mga pagbag-o sa mga uso sa sekondaryang istruktura kumpara sa mga pagbalhin sa kemikal sa αS sa puro nga random coil conformation 68 (Supplementary Figure 5c).Ang mga rate sa R1ρ gisukod pinaagi sa pagrekord sa mga eksperimento sa hsqctretf3gpsi (nakuha gikan sa librarya sa Bruker) nga adunay mga paglangan sa 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ug 800 ms, ug ang mga exponential function gipasibo sa mga paglangan sa peak intensity. mga panahon aron mahibal-an ang R1ρ ug ang kawalay kasiguruhan sa eksperimento niini.
Ang duha ka kolor nga time-resolved fluorescence microscopy nga mga eksperimento gihimo sa usa ka commercial time-resolved MT200 fluorescence confocal microscope (PicoQuant, Berlin, Germany) nga adunay time-correlated single photon counting (TCSPC) device.Ang ulo sa laser diode gigamit alang sa pulsed interleaved excitation (PIE), ang beam moagi sa usa ka mode nga waveguide ug gipunting sa usa ka gahum sa laser nga 10 hangtod 100 nW alang sa 481 nm ug 637 nm nga mga linya sa laser nga gisukod pagkahuman sa usa ka dichroic nga salamin.Kini nagsiguro sa usa ka labing maayo nga photon counting rate, paglikay sa mga epekto sa photon aliasing, photobleaching ug saturation.Ang μ-Slide angiogenesis coverslips o plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) gibutang direkta sa immersion nga tubig ibabaw sa Super Apochromat 60x NA 1.2 lens nga adunay corrective collar (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Usa ka 488/640 nm dichroic nga salamin (Semrock, Lake Forest, IL, USA) gigamit ingon nga nag-unang beam splitter.Ang dili nakapokus nga radiation gibabagan sa usa ka lungag nga adunay diyametro nga 50 microns, unya ang gipunting nga radiation gibahin sa 2 nga mga agianan sa pag-ila pinaagi sa usa ka 50/50 beam splitter.Ang bandpass emission filters (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 para sa green nga tina (AF488) ug 690/70 para sa pula nga tina (Atto647N) gigamit atubangan sa detector.Ang single-photon avalanche diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italy) gigamit isip detector.Parehong pagkolekta ug pagtuki sa datos gihimo gamit ang komersiyal nga magamit nga SymphoTime64 software (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany).
Singkwenta ka microliter sa mga sample sa LLPS ang gipadapat sa mga atabay sa μ-Slide angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany).Ang resulta nga mga hulagway gipunting ngadto sa 20 µm sa ibabaw sa atabay sa ubos alang sa labing maayo nga tumong nga gilay-on sa pagtrabaho alang sa gisuspinde nga mga tinulo ug ngadto sa ~ 1 µm alang sa mga balsa ug mga tuldok nga adunay axial nga resolusyon nga labing menos 0.25 µm/pixel ug usa ka oras sa paglangan nga 400 µs/pixel.Pagpili og datos pinaagi sa paggamit ug intensity threshold base sa average nga background signal intensity (PBG, mean + 2σ) para sa matag channel aron ang liquid protein droplets, rafts, o spots lang ang mapili, nga magsala sa bisan unsang posibleng gigikanan gikan sa dispersed phase.Aron pag-analisar sa gitas-on sa kinabuhi sa matag species (τ) sa matag channel (berde, "g" alang sa AF488 ug pula, "r" alang sa Atto647N), gipili namo ang mga rehiyon sa interes (ROI) nga adunay mga tinulo, balsa, o mga spots (Supplementary Figure 1). ).8b) ug nakuha kini pinaagi sa pagpahaom sa ilang tibuok kinabuhi nga pagkadunot (τD, τR ug τP para sa mga tinulo, balsa o spots, matag usa, tan-awa ang Supplementary Fig. 8c) sa matag channel gamit ang tail-fit analysis ug two-component decay model.Average nga τ gikan sa τ .Ang mga ROI nga nagpatunghag gamay ra kaayo nga mga photon alang sa usa ka multi-exponential fit wala iapil sa pagtuki.Ang cutoff nga gigamit mao ang <104 photon alang sa mga balsa ug tuldok ug 103 alang sa mga tinulo.Ang mga tinulo adunay mas ubos nga threshold tungod kay lisud ang pagkuha sa mga kurba sa pagkadunot nga adunay mas taas nga mga kantidad sa intensity, tungod kay ang mga tinulo sa natad sa imahe kasagaran mas gamay ug dili kaayo daghan.Ang mga ROI nga adunay mga ihap sa photon nga labaw sa limitasyon sa pagtipon sa photon (gitakda sa> 500 nga ihap / pixel) gisalikway usab alang sa pagtuki.Ipares ang intensity decay curve nga nakuha gikan sa rehiyon sa interes nga adunay intensity sa 90% sa maximum (gamay human sa maximum intensity sa decay) gikan sa sinugdanan sa kinabuhi sa serbisyo aron masiguro ang gamay nga interference sa IRF samtang nagpabilin ang parehas alang sa tanan nga intensity decay Mga setting Relative time window Gisusi ang 25 ngadto sa 50 ROI alang sa mga balsa ug mga spots ug 15-25 ROI alang sa mga tinulo, mga hulagway nga gipili gikan sa labaw sa 4 nga mga replika nga natala gikan sa labing menos 3 nga independente nga mga eksperimento.Ang duha ka ikog nga t-test gigamit sa pagtimbang-timbang sa mga kalainan sa istatistika tali sa mga espisye o tali sa mga coacervate nga sistema.Alang sa usa ka pixel-by-pixel nga pagtuki sa tibuok kinabuhi (τ), ang kinatibuk-ang attenuation sa tibuok kinabuhi sa ibabaw sa kapatagan alang sa matag channel gikalkulo ug usa ka gibanabana nga usa ka 2/3-component exponential attenuation model ang gihimo.Ang tibuok kinabuhi nga attenuation alang sa matag pixel gihaum dayon gamit ang naunang kalkulado nga τ values, nga miresulta sa pseudocolor FLIM fit image.Ang tail-fit lifetime range parehas sa tanan nga mga imahe sa parehas nga channel, ug ang matag pagkadunot nagpatunghag igo nga mga photon aron makahatag usa ka kasaligan nga angay.Alang sa pagtuki sa FRET, ang mga pixel gipili pinaagi sa paggamit sa ubos nga intensity threshold sa 100 ka mga photon, nga nag-average sa background signal (FBG) sa 11 ka mga photon.Ang fluorescence intensity sa matag channel gitul-id pinaagi sa eksperimento nga gitino nga correction factor: 69 spectral crosstalk α mao ang 0.004, direkta nga excitation β mao ang 0.0305, detection efficiency γ mao ang 0.517.Ang kahusayan sa FRET sa lebel sa pixel gikalkulo gamit ang mosunod nga equation:
diin ang FDD mao ang fluorescence intensity nga naobserbahan sa donor (green) channel, ang FDA mao ang fluorescence intensity nga nakita sa acceptor (pula) nga channel ubos sa indirect excitation, ug ang FAA mao ang fluorescence intensity nga nakita sa acceptor (red) channel ubos sa direct excitation ( PIE).Ang fluorescence intensity pulses naobserbahan sa channel).
Ibutang ang 100 µl sa LLPS reaction solutions nga adunay 25 µM unlabeled monomeric Tau441 (nga adunay o walay 25 µM αS) sa LLPS buffer (supplemented sama sa ibabaw) sa non-binding 96-well microplates nga adunay adhesive foil coating ug droplet formation nga gisusi human gisusi sa WF micros pagkabalanse.sulod sa 10 min.Pagkahuman sa 48 ka oras nga paglumlum sa temperatura sa kwarto, ang presensya sa mga balsa sa protina ug mga spots nakumpirma.Dayon kuhaa pag-ayo ang likido ibabaw sa mga balsa gikan sa mga atabay, dayon idugang ang 50 L nga dissociation buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ug i-incubate sulod sa 10 min.Ang taas nga konsentrasyon sa asin nagsiguro nga ang LLPS dili na masubli tungod sa nahabilin nga PEG, ug ang posible nga mga asembliya sa protina nga naporma lamang sa mga interaksyon sa electrostatic mabungkag.Ang ilawom sa atabay maampingong gikiskis gamit ang tip sa micropipette ug ang resulta nga solusyon gibalhin sa usa ka walay sulod nga atabay sa obserbasyon.Human sa paglumlum sa mga sample nga adunay 50 μM ThT sulod sa 1 ka oras, ang presensya sa nahilit nga mga spots gisusi sa WF microscopy.Pag-andam sa sonicated αS fibrils pinaagi sa paglumlom sa 300 µl sa usa ka 70-µM αS nga solusyon sa PBS nga adunay pH 7.4, sodium azide 0.01% sa 37 °C ug 200 rpm sa usa ka orbital shaker sulod sa 7 ka adlaw.Ang solusyon dayon centrifuged sa 9600 × g alang sa 30 min, ang pellet gisuspinde pag-usab sa PBS pH 7.4 ug sonicated (1 min, 50% cycle, 80% amplitude sa usa ka Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) fibril samples nga adunay medyo parehas nga gidak-on nga pag-apod-apod sa gagmay nga mga fibril.
Ang pag-analisa sa FCS/FCCS ug ang two-color coincidence detection (TCCD) gihimo sa parehas nga MT200 nga time-resolved fluorescent confocal microscope (Pico-Quant, Berlin, Germany) nga gigamit alang sa FLIM-FRET microscopy nga mga eksperimento gamit ang PIE mode.Ang gahum sa laser alang niini nga mga eksperimento gidugang sa 6.0 µW (481 nm) ug 6.2 µW (637 nm).Ang kombinasyon niini nga mga gahum sa laser gipili aron makahimo og susama nga kahayag alang sa mga pares sa fluorophores nga gigamit samtang nakakab-ot sa kamalaumon nga gidaghanon sa ihap ug paglikay sa photobleaching ug saturation.Ang duha nga pagkolekta ug pagtuki sa datos gihimo gamit ang komersiyal nga magamit nga SymphoTime64 version 2.3 software (PicoQuant, Berlin, Germany).
Ang mga sample sa nahilit nga αS/Tau nga mga aggregate nga nakuha gamit ang LLPS gitunaw sa isolation buffer ngadto sa tukma nga monomolecular nga konsentrasyon (kasagaran usa ka 1:500 dilution, tungod kay ang mga aggregate anaa na sa ubos nga konsentrasyon kung nahimulag gikan sa coacervate sample).Ang mga sample direkta nga gipadapat sa mga coverslips (Corning, USA) nga precoated sa usa ka BSA solution sa konsentrasyon nga 1 mg/mL.
Para sa PIE-smFRET nga pagtuki sa berde ug pula nga mga kanal, usa ka ubos nga intensity threshold sa 25 nga mga photon ang gipadapat aron sa pagsala sa ubos nga intensity signal tungod sa monomeric nga mga panghitabo (timan-i nga ang mga monomer mas daghan kay sa mga aggregated sample kumpara sa nahilit nga mga aggregate).Kini nga threshold gikalkulo ingon nga lima ka pilo sa kasagaran nga intensity sa monomeric αS nga nakuha gikan sa pag-analisa sa puro nga mga sample sa monomer aron espesipikong mapili ang mga aggregate alang sa pagtuki.Ang PIE drive circuit, uban sa TSCPC data acquisition, nakapahimo sa paggamit sa usa ka tibuok kinabuhi nga weighting filter nga makatabang sa pagwagtang sa background ug spectral crosstalk.Ang flare intensity nga gipili gamit ang mga threshold sa ibabaw gitul-id gamit ang average nga background signal nga gitino gikan sa histograms of occurrence versus intensity/bin sa buffer-only samples.Ang mga pagbuto nga nalangkit sa dagkong mga aggregate kasagarang nag-okupar sa daghang sunod-sunod nga mga bin sa pagsubay sa oras (gitakda sa 1 ms).Sa kini nga mga kaso, gipili ang usa ka bin nga adunay labing kadaghan nga kusog.Alang sa FRET ug stoichiometric analysis, gigamit ang theoretically determinated gamma factor γ (0.517).Ang spectral crosstalk ug direkta nga excitation nga mga kontribusyon wala'y bili (determinado sa eksperimento) sa gigamit nga gahum sa laser sa ekscitation.Ang kahusayan ug stoichiometry sa FRET sa usa ka pagbuto gikalkula ingon sa mosunod.