ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Para sa Chemical Industry nga kemikal nga sangkap, Ang kakulangan sa SPECC1L nagdala sa dugang nga kalig-on sa mga spliced ​​joints ug pagkunhod sa pag-ula sa cranial neural crest cells.

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Naggamit ka usa ka bersyon sa browser nga adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, gipakita namon ang site nga wala’y mga istilo ug JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Para sa Industriya sa Kemikal

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.usa ka nanguna nga tiggama nga espesyalista sa stainless steel seamless pipes , bright annealed tubes , seamless coiled tubing etc.Aron mapadali ang mga kustomer, kami adunay mga welded nga tubo ug tubo usab.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.adunay labing abante nga kagamitan sa paghimo ug pagsulay.Kita hingpit nga makatagbaw sa imong gikinahanglan.Sumala sa estrikto kaayo nga sumbanan, ang mga tubo nga gihimo namo kanunay adunay hustong OD ug WT tolerance.Ang pagkontrolar sa pagkamatugtanon hugot nga nahiuyon sa paghimo sa mga sumbanan.Ang among mga produkto kanunay nga matagbaw sa mga kustomer.Ang mga kustomer nga mipalit sa among mga produkto nakamugna og daghang kita.
a) OD (Outer Diameter): 3.18mm ngadto sa 101.6mm
b) WT (Pader Gibag-on): 0.5mm ngadto sa 20mm
c) Gitas-on: Sumala sa kinahanglanon sa kustomer
d) Mga Sumbanan : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ug uban pa
e) Pamaagi sa Proseso: ERW, EFW ug uban pa

Ang mga slider nga nagpakita sa tulo ka mga artikulo matag slide.Gamita ang likod ug sunod nga mga buton sa paglihok sa mga slide, o ang slide controller nga mga buton sa katapusan aron sa paglihok sa matag slide.
Ang cranial neural crest cells (CNCC) motangtang sa embryonic neural folds ug molalin ngadto sa pharyngeal arches, nga naglangkob sa kadaghanan sa midface structures.Ang dysfunction sa CNCC adunay importante nga papel sa etiology sa orofacial cleft, usa ka komon nga congenital malformation.Ang mga mutasyon nga heterozygous SPECC1L nakit-an sa mga pasyente nga adunay atypical ug syndromic clefts.Dinhi, gi-report namon ang gipaayo nga pagmantsa sa mga sangkap nga canonical adhesive junction (AJ), β-catenin ug E-cadherin sa mga kultura nga SPECC1L knockdown nga mga selula, ug ang mga micrograph sa elektron nagpakita sa apical-basal diffusion sa AJ.Aron masabtan ang papel sa SPECC1L sa craniofacial morphogenesis, naghimo kami og Specc1l nga kulang nga modelo sa mouse.Ang mga homozygous mutants kay embryonic lethal ug nagpakita sa kapansanan sa neural tube closure ug CNCC lamination.Ang AJ protein staining nadugangan sa mutant neural folds.Kini nga depekto sa AJ nahiuyon sa usa ka depekto sa delamination sa CNCC, nga nanginahanglan pagtunaw sa AJ.Dugang pa, ang mga mutant sa Specc11 nakapakunhod sa pagsenyas sa PI3K-AKT ug nadugangan ang apoptosis.Sa vitro, ang malumo nga pagdili sa PI3K-AKT nga pagsenyas sa mga wild-type nga mga selula igo na aron maaghat ang mga pagbag-o sa AJ.Importante, ang mga pagbag-o sa AJ nga gipahinabo sa SPECC1L knockdown mahimong balihon pinaagi sa pagpaaktibo sa PI3K-AKT nga agianan.Gikuha, kini nga mga datos nagsugyot nga ang SPECC1L, isip usa ka nobela nga regulator sa PI3K-AKT signaling ug AJ biology, gikinahanglan alang sa neural tube closure ug CNCC stratification.
Ang cranial neural crest cells (CNCCs) nag-localize sa dorsal neuroectoderm ug nagbulag gikan sa neuroepithelium sa nag-develop nga neural folds pinaagi sa proseso nga naglambigit sa epithelial-mesenchymal transition (EMT)1,2,3.Ang premigrating epithelial CNCCs makabalda sa intercellular junctions ug mahimong migrating mesenchymal CNCCs nga mopuno sa una ug ikaduhang pharyngeal arches ug moporma sa kadaghanan sa craniofacial cartilage.Busa, ang mga gene nga nag-regulate sa pag-obra sa CNCC kasagarang mabalda sa etiology sa craniofacial congenital anomalies sama sa orofacial clefts, nga kasagarang makaapekto sa 1/800 nga pagpanganak sa US lamang.Usa sa mga congenital deformity8.
Ang delamination sa CNCC motakdo sa pagsira sa anterior neural tube tali sa 8.5 ug 9.5 nga mga adlaw sa embryonic development sa mga ilaga.Ang mga mutant sa ubay-ubay nga mouse orofacial cleft-associated nga mga gene nagpakita usab sa pipila ka porma sa neural tube defect, lakip ang Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, ug Pdgfrα12.Bisan pa, ang mga proseso sa pagsira sa neural tube ug stratification sa CNCC mahimong isipon nga independente, tungod kay ang Splotch mutant mouse (Pax3) nagpakita sa mga depekto sa pagsira sa neural tube nga wala’y epekto sa stratification o paglalin sa CNCC 13,14.Ang dugang nga mga modelo sa mouse nga adunay mga depekto sa CNCC dissection ug neural tube closure makatabang sa pagdelinear sa komon nga molekular nga basehan niining duha ka proseso.
Ang pagkahimulag sa CNCC gikan sa mga selula sa neuroepithelial nagkinahanglan sa pagbungkag sa mga adhesive junctions (AJs), nga gilangkuban sa mga complex sa protina nga naglangkob, ug uban pa, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, ug α-actinin nga nalangkit sa actin filaments 2 Ang mga pagtuon sa sobrang pagpahayag sa E-cadherin sa neural folds nagpakita sa pagkunhod o paglangan sa delamination sa CNCC.Sa kasukwahi, ang pagsumpo sa E-cadherin moresulta sa sayo nga stratification15,16.Daghan sa mga hinungdan nga nagpataliwala sa EMT atol sa stratification sa CNCC mao ang mga transcription factor (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ug extracellular matrix (ECM) remodeling proteins sama sa matrix metalloproteinases (MMPs), apan ang CNCCs direkta nga cytoskeletal AJ regulators. wala pa mailhi.Ang PI3K-AKT nga agianan nahibal-an nga makasukol sa lebel sa E-cadherin, kasagaran gikan sa panukiduki sa kanser17.Gipakita sa bag-ong mga pagtuon nga ang pagkawala sa PDGFα-based PI3K-AKT signaling sa mga ilaga mosangpot sa craniofacial abnormalities, lakip na ang cleft palate ug neural tube defects12.Bisan pa, ang relasyon tali sa PI3K-AKT nga agianan ug kalig-on sa AJ sa stratification sa CNCC dili klaro.
Giila namo kaniadto ang SPECC1L isip unang mutant gene sa duha ka tawo nga adunay grabe nga liki nga gikan sa baba ngadto sa mata, nailhan nga oblique cleft (ObFC) o Tessier IV18 cleft.Ang mga mutasyon sa SPECC1L giila sa duha ka multigenerational nga mga pamilya nga adunay autosomal dominant Opitz G / BBB syndrome (OMIM #145410), diin ang mga apektadong indibidwal nagpakita sa hyperdistance ug cleft lip/palate19, ug sa usa ka pamilya nga adunay Tibi overdistance syndrome (OMIM #145420)20 .kapin sa katunga sa mga kaso sa Opitz G/BBB syndrome kay X-linked (OMIM #300000) ug tungod sa mutation sa MID1 gene, nga nag-encode sa protina 22 sa microtubule-associated cell skeleton.Gipanghimatuud namo nga ang SPECC1L, usa usab ka protina nga may kalabutan sa microtubule ug ang actin cytoskeleton, mahimong magpataliwala sa pagsenyas nga gikinahanglan alang sa actin cytoskeleton remodeling atol sa cell adhesion ug migration 18.Pinaagi sa in vitro ug in vivo nga mga pagtuon, among gihulagway ang SPECC1L isip usa ka nobela nga regulator sa AJ stability pinaagi sa PI3K-AKT signaling.Sa lebel sa cellular, ang kakulangan sa SPECC1L miresulta sa pagkunhod sa lebel sa pan-AKT nga protina ug pagtaas sa apical-basal dispersion sa AJ, nga giwagtang pinaagi sa kemikal nga pagpaaktibo sa AKT nga agianan.Sa vivo, ang Specc11-kulang nga mga embryo nagpakita sa kapansanan sa neural tube nga pagsira ug pagkunhod sa CNCC dissection.Sa ingon, ang SPECC1L naglihok sa kaayo nga regulated cell adhesion-based signaling nga gikinahanglan alang sa normal nga function sa CNCC atol sa facial morphogenesis.
Aron mahibal-an ang papel sa SPECC1L sa lebel sa cellular, gigamit namon ang nauna nga gihulagway nga lig-on nga linya sa cell sa osteosarcoma nga U2OS nga kulang sa SPECC1L18.Kini nga mga stable nga U2OS nga mga selula nga adunay SPECC1L (kd) knockdown adunay kasarangan (60-70%) nga pagkunhod sa lebel sa SPECC1L transcript ug mga protina, uban ang mga depekto sa paglalin ug pag-organisar pag-usab sa actin cytoskeleton 18. Sa kasukwahi, usa ka grabe nga lumalabay nga pagkunhod sa Ang SPECC1L gipakita nga mosangpot sa mitotic defects 23 .Sa dugang nga pagkilala, nahibal-an namon nga ang among lig-on nga SPECC1L-kd nga mga selyula nagbag-o sa morpolohiya sa usa ka taas nga lebel sa panagsama (Figure 1).Ang tagsa-tagsa nga kontrol nga mga selula ug kd nga mga selula sa ubos nga panagtagbo susama tan-awon (Figure 1A, D).24 ka oras human sa fusion, ang mga control cell nagpabilin sa ilang cuboidal nga porma (Fig. 1B, E), samtang ang SPECC1L-kd nga mga selula nga elongated (Fig. 1C, F).Ang gidak-on sa kini nga pagbag-o sa porma sa cell nakuha pinaagi sa in vivo nga live imaging sa control cells ug kd cells (movie 1).Aron mahibal-an ang papel sa SPECC1L sa mga confluent cells, una namong gisusi ang ekspresyon niini.Nahibal-an namon nga ang lebel sa protina sa SPECC1L misaka sa pagsagol (Figure 1G), samtang ang lebel sa transcript sa SPECC1L wala motaas (Figure 1H).Dugang pa, samtang nagkadako ang densidad sa selula, ang protina sa SPECC1L natipon sa mga utlanan sa intercellular (Fig. 2A-E), nga adunay usa ka sumbanan nga nagsapaw sa β-catenin nga may kalabutan sa lamad (Fig. 2A'-E').Gihatag ang asosasyon sa SPECC1L sa actin cytoskeleton 18,23 among gi-hypothesize nga ang SPECC1L nakig-uban sa actin-based adhesive junctions (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) nga mga selyula sa taas nga panagsama (F) kumpara sa pagkontrol sa U2OS cells (AC).Gipakita dinhi ang tulo sa unom ka mga punto sa oras (T1, T3, T6) nga among gipili alang sa lainlaing mga densidad sa cell.(G) Pag-analisar sa Western blot nga nagpakita nga ang protina sa SPECC1L gipalig-on sa taas nga lebel sa panagsama kumpara sa usa ka ubos nga lebel sa panagtagbo sa mga control cell.Ang Western blot sa SPECC1L nagpakita sa gipaabot nga 120 kDa band ug mas taas nga molecular weight band, posibleng post-translationally modified (*).Ang pag-analisar sa Western blot gihimo ubos sa parehas nga mga kondisyon alang sa ubos ug taas nga panagtagbo.Ang mga hulagway nga nagpakita sa SPECC1L sa ubos ug taas nga panagtagbo gikuha gikan sa samang blot.Ang parehas nga blot gikuha ug gisusi pag-usab gamit ang β-actin antibody.(H) Ang quantitative RT-PCR analysis nagpakita nga walay mahinungdanong kausaban sa SPECC1L transcript nga lebel.Ang mga error bar nagrepresentar sa mga SEM gikan sa upat nga independente nga mga eksperimento.
(AE) Gipili namo ang unom ka mga punto sa oras (T1-T6) nga nagrepresentar sa usa ka hanay sa mga densidad sa cell aron ma-normalize ang pag-analisar sa porma sa cell ug mga pagbag-o sa AJ sa mga selula sa U2OS nga adunay SPECC1L knockdown (kd).Ang unang lima niini nga mga punto sa panahon naglakip sa single cells (T1), 50-70% fusion sa gagmay nga cell clusters (T2), fusion nga walay pag-usab sa kd cells (T3), pag-usab sa kd cells (T4), ug 24 ka oras nga mga kausaban.sa posterior nga porma sa kd (T5) nga mga selula.Ang SPECC1L nga protina kasagarang nagkatibulaag sa cytoplasm sa T1 (A), apan ang pagtipon niini naobserbahan sa intercellular nga mga utlanan sa sunod nga mga punto sa oras (B-E, mga pana).(FJ) β-catenin nagpakita sa susama nga akumulasyon sa intercellular mga utlanan nga nalangkit sa AJ complex.(A'-E') SPECC1L ug β-catenin nagpakita sa nagsapaw nga pagmantsa sa mga utlanan sa selula sa taas nga densidad sa selula (mga pana).(F'-J') Sa SPECC1L-kd cells, ang β-catenin staining makita nga normal sa ubos nga densidad sa selula (F'-H'), apan molapad samtang nagbag-o ang porma sa selula (I', J'; mga pana), nga nagpakita nga ang AJ nausab.Mga bar = 10 µm.
Gisulayan dayon namon nga mahibal-an ang epekto sa kakulangan sa SPECC1L sa AJ.Gigamit namon ang daghang mga marka nga may kalabotan sa AJ, lakip ang mga kanonikal nga sangkap nga F-actin, myosin IIb, β-catenin, ug E-cadherin24,25,26,27.Actin stress fibers misaka sa SPECC1L-kd cells sama sa gihulagway kaniadto (Fig. 3A, B) 18.Ang Myosin IIb nga nakig-uban sa actin filaments nagpakita sa susama nga pagtaas sa SPECC1L-kd nga mga selula sa vitro (Fig. 3C, D).Ang AJ-associated β-catenin nagbugkos sa cadherin sa cell membrane, nga nagpakita sa usa ka normal nga "honeycomb" expression pattern sa control cubocytes (Fig. 3E, G).Makaiikag, sa patag nga mga hulagway gamit ang confocal microscopy, β-catenin (Fig. 3E, F) ug E-cadherin (Fig. 3G, H) nga pag-stain sa cell lamad sa mga confluent nga SPECC1L-deficient nga mga selula nagpakita sa prominenteng mga sumbanan sa dugay nga pagmantsa.Kini nga pagpalapad sa AJ-associated β-catenin staining sa kd cells labing gipahayag sa panagtagbo, apan nagpakita nga nag-una sa mga kausaban sa porma sa selula (Fig. 2F-J, F'-J').Aron mahibal-an ang pisikal nga kinaiyahan sa kini nga gipalawig nga pag-stain sa AJ, among gisusi ang mga utlanan sa cell sa apical-basal nga nawong sa SPECC1L-kd U2OS nga mga selula pinaagi sa transmission electron microscopy (TEM) (Figure 3I, J).Sukwahi sa pagkontrolar sa mga selula (Fig. 3I), nga adunay separado nga electron dasok nga mga rehiyon nga nagpaila sa AJ (mga pana), ang mga selula sa kd (Fig. 3J) nagpakita sa dako, nagkadugtong nga mga rehiyon nga adunay taas nga electron density nga nagpaila sa AJ ubay sa eroplano sa apicobasal..Dugang pa, sa transverse nga mga seksyon, among naobserbahan ang halapad nga cell membrane folds sa kd cells (Fig. S1A, B), nga nagpatin-aw sa gipalapad nga pattern sa β-catenin ug E-cadherin staining bands (Fig. 3F, H).Sa pagsuporta sa papel sa SPECC1L sa AJs, ang β-catenin gi-co-immunoprecipitated sa SPECC1L sa lysates sa confluent U2OS cells (Fig. 3K).Kauban sa gipalawig nga immunostaining alang sa mga marka sa AJ, ang pag-analisar sa TEM nahiuyon sa among hypothesis nga ang kakulangan sa SPECC1L nagdugang AJ apical-basal density ug kalainan.
(AH) Dugang nga F-actin staining sa kd cells sa 48 ka oras nga post-fusion (T6; A, B).Giusab nga pagmantsa sa myosin IIb nga nakig-uban sa F-actin (C, D).Ang hapsay nga sumbanan sa β-catenin ug E-cadherin lamad nga pag-stain sa control cells (E, G) gipalambo sa SPECC1L-kd (F, H) nga mga selula.Mga bar = 10 µm.(I-J) Electron micrographs nga nag-obserbar sa apical-basal intercellular junction.Ang mga control cell nagpakita sa lahi nga electron-dense nga mga rehiyon nga nagpakita sa mga sticky junctions (I, mga arrow).Sa kasukwahi, ang tibuok nga apical-basal junction sa SPECC1L-kd nga mga selula nagpakita nga electron dense (J, arrow), nga nagpakita sa dugang nga densidad ug pagkatibulaag sa adhesive junctions.(K) β-catenin co-immunoprecipitated sa SPECC1L sa confluent U2OS cell lysates.Ang hulagway nga gikuha gikan sa usa ka dapit nga nagrepresentar sa usa sa upat ka independenteng mga eksperimento.
Aron masabtan ang papel sa SPECC1L sa craniofacial morphogenesis, naghimo kami og Specc1l deficient nga modelo sa mouse gamit ang duha ka independenteng ES trap cell lines, DTM096 ug RRH048 (BayGenomics, CA), nga nagrepresentar sa intron 1 ug Specc1l transcript nga nakuha sa 15 (Fig. 1) .4A, numero S2).Ang genomic nga lokasyon sa decoy vector insert gitino pinaagi sa tibuok genome sequencing ug gikumpirma sa PCR (Fig. S2).Ang duha ka gene trap nga mga disenyo nagtugot usab sa in-frame fusion sa Specc11-lacZ nga mga tigbalita sa pagkadakop.Busa, ang lacZ nga ekspresyon nga gitino sa X-gal staining gigamit isip timailhan sa Specc11 nga ekspresyon.Ang duha ka alleles nagpakita sa susama nga lacZ expression patterns, uban sa DTM096 gene trap sa intron 1 nga nagpakita sa mas lig-on nga ekspresyon kay sa RRH048 sa intron 15 (wala gipakita).Bisan pa, ang Specc1l kaylap nga gipahayag, nga adunay labi ka kusgan nga ekspresyon sa neural folds sa E8.5 (Figure 4B), sa neural tube ug mga proseso sa nawong sa E9.5 ug E10.5 (Figure 4C, D), ug sa pagpalambo sa mga bukton. sa e10.5 ug mga mata (Figure 4D).Gi-report namon kaniadto nga ang ekspresyon sa SPECC1L sa una nga pharyngeal arch sa E10.5 naa sa epithelium ug nagpahiping mesenchyme18, nga nahiuyon sa linya sa CNCC.Aron masulayan ang ekspresyon sa SPECC1L sa CNCC, among gihimo ang E8.5 neural folds (Figure 4E-J) ug E9.5 skull sections (Figure 4K-).Sa E8.5, ang SPECC1L nagpintal sa mga neural folds nga grabe (Fig. 4E, H), lakip ang mga selula nga namansahan sa NCC marker (Fig. 4G, J).Sa E9.5, ang SPECC1L (Fig. 4K, N) kusganong nabulit sa migrating CNCC co-stained sa AP2A (Fig. 4L, M) o SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Schematic representation sa mouse Specc11 gene nga nagpakita sa decoy vector insertion sa ES DTM096 (intron 1) ug RRH048 (intron 15) cell clones.(BD) lacZ staining sa heterozygous Specc1lDTM096 embryo nga nagrepresentar sa Specc1l nga ekspresyon gikan sa E8.5 ngadto sa E10.5.NE = neuroectoderm, NF = neural fold, PA1 = una nga pharyngeal arch.(EP) SPECC1L immunostaining sa NCC marker AP2A ug SOX10 sa E8.5 (NF; EJ) neural folds ug E9.5 (KP) skull sections.Ang pagmantsa sa SPECC1L kaylap nga nakita sa neural folds E8.5 (E, H; arrowheads), lakip ang mga cell nga gimarkahan sa AP2A (F, G; arrowheads) ug SOX10 (I, J; arrowheads).Sa E9.5, ang SPECC1L kusganong nagmantsa sa migrating CNCCs (K, N; arrow) nga adunay label nga AP2A (L, M; arrow) ug SOX10 (O, P; arrow).
Ang pagtabok tali sa heterozygous Specc1lDTM096/+ ug Specc1lRRH048/+ nga mga ilaga nagpakita nga ang duha ka gene trap alleles dili complementary ug ang compound heterozygotes ug embryonic homozygotes alang sa gene trap allele kay embryonic lethal (Table S1).Ang mga ratios sa Mendelian nagpakita sa pagkunhod sa survival rate sa heterozygotes sa pagkahimugso (gipaabot nga 1.34 kumpara sa 2.0).Among namatikdan ang ubos nga perinatal mortality sa mga heterozygotes, ang uban adunay craniofacial anomalies (Fig. S3).Bisan pa, ang ubos nga pagsulod niining mga perinatal craniofacial phenotypes nagpalisud sa pagtuon sa ilang nagpahiping mga mekanismo sa pathophysiological.Busa, naka-focus kami sa embryonic lethal phenotype sa homozygous Specc11 mutants.
Kadaghanan sa compound heterozygous o homozygous Specc1lDTM096 / RRH048 mutant embryo wala maugmad human sa E9.5-10.5 (Fig. 5A-D), ug ang neural tube wala magsira sa anteriorly (Fig. 5B, D) ug usahay sirado sa likod (wala gipakita) ..Kini nga cranial neural tube closure defect nalangkit sa kadaghanan sa CNCC nga gimarkahan nga DLX2 nga nahabilin sa neural folds sa E10.5, nga nagpakita nga walay dissection (Figure 5A'-D').Aron mahibal-an kung ang kinatibuk-ang gidak-on sa CNCC gipakunhod usab, among gi-tag ang mga linya sa CNCC nga adunay GFP sa among mga linya sa gene trap nga adunay Wnt1-Cre ug ROSAmTmG.Gi-stream namo ang GFP+ NCC ug GFP- (RFP+) nga dili NCC gikan sa tibuok nga mga embryo.Sa E9.5, ang proporsiyon sa flow-sorted GFP-labeled CNCCs wala kaayo mausab tali sa WT ug mutant embryo (wala gipakita), nga nagpakita sa normal nga CNCC specification.Busa, among gi-hypothesize nga ang nahabilin nga Wnt1-Cre ug DLX2 staining sa gibutyag nga neural folds (Figure 5B ') tungod sa depekto nga CNCC layering, lagmit tungod sa dugang nga densidad o pagkatibulaag sa mga selula sa AJ, sama sa makita sa SPECC1L-kd nga mga selula.Gigamit namon ang mga marka sa NCC nga SOX10, AP2A, ug DLX2 aron makumpirma ang presensya sa CNCC sa neural fold (Figure 5E-R).Sa E8.5, ang neural fold staining alang sa tanang tulo ka NCC marker naobserbahan sa mga seksyon sa WT (Fig. 5E, G, I) ug Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).Sa E9.5, samtang ang mga marker sa NCC nagmantsa sa migrating NCC sa mga seksyon sa WT (Fig. 5M, O, Q), ang nahabilin nga NCC staining nakita sa gibutyag nga neural folds sa Specc1l mutant embryo (Fig. 5N, P, R).Tungod kay ang SOX10 ug DLX2 nagtimaan sa paglalin sa mga CNCC, kini nga resulta nagsugyot nga ang SPECC1L-kulang nga mga CNCC nakakab-ot sa post-migratory nga detalye apan napakyas sa paglalin gikan sa neural folds.
Ang kakulangan sa Specc11 nagdala sa depekto nga pagsira sa neural tube, delamination sa cranial neural crest cells ug AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo nga nagdala sa migrating cranial neural crest cells (CNCC) nga gimarkahan og Wnt1-Cre (A').Sa kasukwahi, ang Specc11 mutant embryo nagpakita sa bukas nga neural folds (B), arrowheads) ug CNCCs nga wala migrate (B', arrowheads).(C, D') Bright field images (C, D') ug immunostaining (C', D') sa CNCC marker DLX2 sa E10.5 WT embryos (C, C') ug Specc1l (D, D').Sa WT E10.5 nga mga embryo, ang DLX2-positibo nga CNCC nag-colonize sa gill arches (C', arrows), samtang sa mga mutant, ang makita nga pagmantsa nagpadayon sa bukas nga neural folds (D', arrow) ug sa unang pharyngeal arches (D', mga pana).) nga adunay pipila nga pagmantsa (mga pana) nga nagpakita sa dili maayo nga delamination ug paglalin sa CNCC.ER) Ang mga seksyon sa WT ug Specc1l mutant embryo sa mga yugto nga E8.5 (E–L) ug E9.5 (M–R) gimarkahan og NCC marker SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) ug DLX2 (I, J, Q, R).Sa E8.5, ang NCC staining nakita sa wild-type neural fold (NF) ug mutant nga mga seksyon.Ang co-staining sa SOX10 ug β-catenin sa E8.5 WT (K) ug mutant (L) nagpadayag sa pagtaas sa β-catenin staining sa cell boundaries sa neural folds.Sa E9.5, ang wild-type nga pag-stain sa migrating CNCCs (M, O, Q) naobserbahan, samtang sa mga mutant, ang unstratified CNCCs nagmantsa sa bukas nga neural folds (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ labeling analysis sa coronal section sa WT ug Specc11DTM096/RRH048 nga mga embryo nga adunay mutation nga E9.5.Ang usa ka gibanabana nga sectional nga eroplano gipakita sa taas nga tuo nga suok.Sa mga seksyon sa mutant tissue, naobserbahan ang dugang nga pagmantsa sa F-actin (S, T) ug myosin IIb (U, V).Susama sa mga resulta sa in vitro sa Fig. 3, sa mutant embryo, ang gipaayo nga lamad sa lamad alang sa β-catenin (W, X) ug E-cadherin (Y, Z) naobserbahan.(AA-BB) Usa ka electron micrograph sa usa ka seksyon sa usa ka wild-type nga embryo nga nagtan-aw sa unahan sa utlanan sa apical-basal cell nagpakita sa lahi nga electron-dense nga rehiyon nga nagpaila sa adhesive junctions (AA, mga pana).Sa kasukwahi, sa mga seksyon sa Specc11 mutant embryo (BB, arrows), ang tibuok apicobasal junction kay electron siksik, nga nagpakita sa usa ka dugang nga Densidad ug pagkatibulaag sa adhesive junctions.
Aron masulayan ang among pangagpas nga ang pagkunhod sa layering tungod sa giusab nga AJ, among gisusi ang AJ labeling sa nabutyag nga neural folds sa Specc1l mutant embryos (Fig. 5S-Z).Among naobserbahan ang pagtaas sa actin stress fibers (Fig. 5S, T) ug usa ka dungan nga pagdugang localization sa myosin IIB staining sa actin fibers (Fig. 5U, V).Importante, among naobserbahan ang dugang nga pagmantsa sa β-catenin (Fig. 5W, X) ug E-cadherin (Fig. 5Y, Z) sa intercellular boundaries.Gisusi usab namo ang β-catenin staining sa NCC sa neural folds sa E8.5 nga mga embryo (Fig. 5K, L).Ang β-catenin staining nagpakita nga mas lig-on sa Specc1l mutant neural folds (Fig. 5L ug K), nga nagsugyot nga ang mga pagbag-o sa AJ nagsugod na.Sa electron micrographs sa mga seksyon sa kalabera sa E9.5 nga mga embryo, among naobserbahan pag-usab ang nagkadaghang diffuse electron-dense staining sa Specc1l mutant embryos kumpara sa WT (Fig. 5AA, BB ug S1E-H).Sa tingub, kini nga mga resulta nagsuporta sa among in vitro nga mga resulta sa SPECC1L-kd U2OS nga mga selula ug nagsugyot nga ang aberrant AJ staining nag-una sa CNCC stratification sa among mutant embryo.
Tungod sa nahibal-an nga antagonistic nga relasyon tali sa kalihokan sa AKT ug kalig-on sa E-cadherin, 17,28 among gipasiugda ang pagkalambigit sa PI3K-AKT signaling.Dugang pa, among naobserbahan ang subepidermal blistering sa pipila sa among mutant nga mga embryo nga nakalingkawas sa lethality (<5%) sa E9.5-10.5 ug hinuon mipuyo sa palibot sa E13.5 (Fig. S3).Ang mga subepidermal vesicle usa ka timaan sa pagkunhod sa PI3K-AKT signaling base sa PDGFRα12.Fantauzzo ug uban pa.(2014) nagtaho nga ang pagkabalda sa PDGFRα-based PI3K activation sa PdgfraPI3K/PI3K mutant embryos moresulta sa subepidermal vesicles, neural tube defects, ug cleft palate phenotypes.Sa tinuud, ang lebel sa pan-AKT ug aktibo nga phosphorylated Ser473-AKT gipakunhod sa vivo sa Specc1l mutant tissues ngadto sa E9.5 embryonic arrest (Fig. 6A-D).Ang pagkunhod sa lebel sa phosphorylated Ser473-AKT mahimong bug-os tungod sa pagkunhod sa lebel sa pan-AKT sa vivo (FIG. 6E) ug in vitro (FIG. 6F).Ang usa ka pagkunhod sa in vitro naobserbahan lamang kung ang mga selula sa U2OS kusog nga nakig-uban sa mga pagbag-o sa porma sa cell ug Densidad sa AJ (Figure 6D).Sa ingon, ang among datos nagsugyot nga ang SPECC1L usa ka nobela nga positibo nga regulator sa PI3K-AKT signaling sa craniofacial morphogenesis.
(A–E) E8.5 (A,B) ug E9.5 (C,D) nga mga seksyon sa kalabera o E9.5 lysates gikan sa Specc1l mutant embryos (E) nga nagpakita sa lebel sa aktibong phosphorylated S473-AKT ug pan-AKT nga pagkunhod sa Protein , itandi sa pagkontrolar sa WT.Ang Western blotting gihimo sa wild-type lysates ug mutant lysates ubos sa parehas nga kondisyon.Ang mga hulagway nga gipakita para sa SPECC1L gikuha gikan sa usa ka blot.Ang parehas nga blot gikuha ug gisusi pag-usab sa anti-pan-ACT ug β-actin antibodies.Ang mga lebel sa Pan-AKT sa E8.5 neural folds (A, B) ug ang lebel sa phosphorylated S473-AKT sa E9.5 nga mga seksyon sa kalabera mikunhod pag-ayo.(F) Ang lebel sa Pan-AKT parehas nga pagkunhod sa mga lysates sa SPECC1L-kd U2OS nga mga selula nga naani sa taas nga panagtagbo.Ang mga error bar nagrepresentar sa mga SEM gikan sa tulo ka independente nga Western blot quantifications.(GJ) Ang mga seksyon sa WT nga mga embryo sa E9.5 nga namansahan sa KI67 ug giputol nga caspase 3, matag usa, nagpakita sa pagdaghan sa selula (G, G ') ug gamay nga apoptotic nga kalihokan (H, H ').Ang Specc11 mutant nga mga embryo nagpakita sa ikatandi nga pagdaghan sa selula (I), apan ang gidaghanon sa mga selula nga nagpailalom sa apoptosis mitaas pag-ayo (J).
Gisusi dayon namo ang mga marker sa proliferation ug apoptosis.Wala kami nakamatikod sa bisan unsang kalainan sa pagdaghan sa E9.5 nga mga embryo (Fig. 6E, G kumpara sa I) nga adunay proliferation index nga 82.5% alang sa WT mutant ug 86.5% alang sa Specc1l mutants nga gisukod sa KI67 staining (p <0.56, Fisher's). eksakto nga pagsulay).Sa susama, wala kami nakamatikod sa bisan unsang kalainan sa apoptosis nga gisukod pinaagi sa pag-staining alang sa cleaved caspase 3 sa neural folds sa E8.5 hangtod sa pag-aresto sa embryo (wala gipakita) (wala gipakita).Sa kasukwahi, ang apoptosis miuswag pag-ayo sa tanang E9.5 mutant embryo (Fig. 6F, H ug J).Kini nga kinatibuk-ang pagtaas sa apoptosis nahiuyon sa pagkunhod sa PI3K-AKT signaling ug sayo nga embryonic lethality29,30,31.
Sunod, aron makumpirma ang usa ka hinungdan nga papel alang sa PI3K-AKT nga pagsenyas sa mga pagbag-o sa AJ sa among mga selula sa kd, giusab namon ang kemikal nga agianan sa kontrol ug mga selula sa kd (Figure 7A-F).Gigamit namo isip marker ang cell shape change phenotype nga nakita sa confluent SPECC1L-kd cells, nga among gi-quantified gamit ang ratio sa pinakataas nga dimensyon (gitas-on) ngadto sa katumbas nga bertikal nga dimensyon (lapad).Ang ratio nga 1 gilauman alang sa medyo lingin o cuboidal nga mga selula (Figure 7G).Dugang pa sa porma sa selula, gipamatud-an usab namo ang epekto sa AJ pinaagi sa β-catenin staining (Fig. 7A'-F').Ang pagpugong sa PI3K-AKT nga agianan gamit ang wortmannin igo na aron mabag-o ang porma sa cell sa mga control cell (Figure 7A, C) ug AJ (Figure 7A ').Ang PI3K-AKT activator SC-79 wala makaapekto sa porma sa selula (FIG. 7A, E) o AJ expansion (FIG. 7A ') sa control cells.Sa SPECC1L-kd nga mga selula, ang dugang nga pagsumpo sa PI3K-AKT nga agianan miresulta sa dugang nga apoptosis (Fig. 7B, D) ug usa ka marka nga pagtaas sa β-catenin staining (Fig. 7B '), nga nahiuyon sa among in vivo heavy mutants.Mahinungdanon, ang pagpaaktibo sa PI3K-AKT nga agianan labi nga nagpauswag sa porma sa cell (Figure 7B, F) ug AJ phenotypes (Figure 7B ”).Ang mga pagbag-o sa porma sa selula gi-quantified isip cell roundness ratio (CCR) ug gitandi sa kamahinungdanon sama sa gihulagway sa ibabaw (FIG. 7G).Sa tinuud, sa mga control cell (Fig. 7G, CCR = 1.56), ang wortmannin nga pagtambal igo na aron mabag-o pag-ayo ang porma sa cell (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) sa gidak-on nga susama sa usa nga naobserbahan. sa SPECC1L.-kd cells (Fig. 7G, CCR = 3.46).Ang Wortmannin nga pagtambal sa SPECC1L-kd cells (Fig. 7G, CCR = 3.60, negligible) dili mas mahinungdanon kay sa wala matambalan nga kd cells (Fig. 7G, CCR = 3.46, negligible) o wortmannin-treated control cells (Fig. 7G)., CCR = 3.46, negligible) dugang makaapekto sa cell elongation (7G, CCR = 3.61, negligible).Labing hinungdanon, gipahiuli sa SC-79 AKT activator ang elongated phenotype sa SPECC1L-kd cells (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Kini nga mga resulta nagpamatuod nga ang SPECC1L nag-regulate sa PI3K-AKT signaling ug nagsugyot nga ang kasarangang pagkunhod sa SPECC1L makaapekto sa cell adhesion, samtang ang kusog nga pagkunhod mosangpot sa apoptosis (Fig. 8).
(A–F') Control (A, C, E) ug SPECC1L-kd (B, D, F) nga mga selula nga gitambalan sa PI3K-AKT pathway inhibitor wortmannin (C, D) o SC-79 activator (E, F) Treatment .Ang wala matambalan nga mga control cell maoy cuboidal (A) nga adunay normal nga β-cat cellular staining (A'), samtang ang kd cells kay elongated (B) nga adunay dugang nga β-cat staining (B').Pagkahuman sa pagsumpo sa agianan sa PI3K-AKT, ang mga control cell nga gipahaba (C) nga adunay pagpalapad sa β-cat (C'), samtang ang mga selula sa kd nagsugod sa pag-agi sa apoptosis (D), parehas sa among kaayo nga mutated nga mga embryo ug nagpakita sa labi ka gipaayo nga β-cat.pagmantsa (D').Human sa pagpaaktibo sa PI3K-AKT nga agianan, ang mga control cell nagpabilin nga cuboidal (E) ug adunay normal nga β-cat (E') staining, samtang ang kd cells nagpakita sa kamahinungdanon nga pagpalambo sa porma sa selula (F) ug β-cat (F') nga pag-stain, nga nagpakita (G) Ang lebel sa pagbag-o sa porma sa selula sa (AF) gi-quantified gamit ang cell roundness ratio (CCR) sa pinakataas nga dimensyon (gitas-on) ug ang katugbang nga bertikal nga dimensyon (lapad) gamit ang MetaMorph software.Ang wala matambalan (NT) SPECC1L-kd nga mga selula (CCR = 3.46) mas taas kay sa mga control cell (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Ang pagdili ni Wort sa PI3K-AKT nga agianan sa control cells igo na nga hinungdan sa usa ka susama nga elongation sa cell shape (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Sa susama, ang pagpaaktibo sa AKT sa SC-79 sa SPECC1L-kd nga mga selula nagpasig-uli sa elongation sa cell aron makontrol ang lebel (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Ang Wortmannin nga pagtambal sa SPECC1L-kd nga mga selula miresulta sa dugang nga apoptosis apan walay dugang nga pagtaas sa kausaban sa porma sa selula (CCR=3.60) kon itandi sa wala matambalan nga kd (CCR=3.46, ns) o wortmannin-treated control cells (3.61) nga naobserbahan sa .ns = dili igsapayan.+/- Ang mga pagsukod sa SEM para sa 50 ka mga selula gipakita.Ang mga kalainan sa estadistika gikalkulo gamit ang t-test sa Estudyante.
(A) Ang eskematiko nga representasyon sa pagdili ug pagpaaktibo sa PI3K-AKT nga agianan nga miresulta sa mga pagbag-o ug pagluwas sa AJ, matag usa.(B) Gisugyot nga modelo alang sa pagpalig-on sa protina sa AKT pinaagi sa SPECC1L.
Ang premigratory CNCCs nagkinahanglan sa AJ lysis nga magbulag gikan sa anterior neural fold neuroepithelial cells1,15,32.Ang dugang nga pagmantsa sa mga sangkap sa AJ ug pagkawala sa apical-basal AJ asymmetric distribution sa SPECC1L-deficient nga mga selula sa vitro ug in vivo, inubanan sa pisikal nga kaduol sa SPECC1L ngadto sa β-catenin, nagsugyot nga ang SPECC1L naglihok aron sa hustong pagmintinar sa AJ lokal nga kalig-on alang sa kaunuran sa organisasyon.actin cytoskeleton.Ang asosasyon sa SPECC1L sa actin cytoskeleton ug β-catenin ug ang pagtaas sa gidaghanon sa mga condensed actin filaments sa pagkawala sa SPECC1L nahiuyon sa nakita nga pagtaas sa AJ density.Ang laing posibilidad mao nga ang usa ka dugang nga gidaghanon sa mga actin fibers sa SPECC1L-kulang nga mga selula mosangpot sa usa ka kausaban sa intercellular tensyon.Tungod kay ang cellular stress makaapekto sa AJ 33 dynamics, ang mga pagbag-o sa boltahe mahimong moresulta sa dugang nga diffuse AJ 34 .Busa ang bisan unsang kausaban makaapekto sa CNCC layers.
Ang Wnt1 gipahayag sa sayo nga neural folds nga nagpatungha sa neural crest cells.Busa, ang Wnt1-cre lineage tracing nagtimaan sa pre- ug migrating NCC35.Bisan pa, ang Wnt1 usab nagtimaan sa dorsal nga mga clone sa tisyu sa utok nga nakuha usab gikan sa sayo nga neural folds 35,36, nga lagmit nga ang among pagmantsa sa E9.5 mutant alang sa mga marka sa Wnt1 sa bukas nga neural folds dili CNCC.Ang among positibo nga pagmantsa alang sa mga marka sa NCC AP2A ug SOX10 nagpamatuod nga ang gibutyag nga neural folds sa Specc11 mutant embryo sa tinuud adunay CNCC.Dugang pa, tungod kay ang AP2A ug SOX10 mga timaan sa sayo nga paglalin sa NCC, ang positibo nga pagmantsa nagpakita nga kini nga mga selula mao ang post-migratory nga CNCC nga dili ma-stratified sa E9.5.
Gisugyot sa among datos nga ang regulasyon sa molekula sa AJ pinaagi sa SPECC1L gipataliwala sa pagsenyas sa PI3K-AKT.Ang pagsenyas sa AKT gikunhoran sa kulang nga mga selula ug tisyu sa SPECC1L.Nakaplagan ni Fantauzzo et al.pagsuporta sa usa ka direkta nga papel alang sa PI3K-AKT signaling sa craniofacial morphogenesis.(2014) nagpakita nga ang kakulang sa pagpaaktibo sa PDGFRα-based PI3K-AKT signaling mosangpot sa usa ka cleft palate phenotype.Gipakita usab namon nga ang pagpugong sa PI3K-AKT nga agianan igo na aron mabag-o ang AJ ug porma sa cell sa mga selula sa U2OS.Nahiuyon sa among nahibal-an, Cain et al.37 nagpakita nga ang downregulation sa PI3K α110 subunit sa endothelial cells moresulta sa susama nga pagtaas sa pericellular β-catenin staining, nga gitawag nga pagtaas sa "connectivity index".Bisan pa, sa mga selula sa endothelial kansang mga filament sa actin organisado na kaayo, ang pagsumpo sa agianan sa PI3K-AKT nagresulta sa usa ka loose cell nga porma.Sa kasukwahi, ang SPECC1L-kd U2OS nga mga selula nagpakita sa usa ka taas nga porma sa selula.Kini nga kalainan mahimong piho nga tipo sa cell.Samtang ang pagsumpo sa PI3K-AKT nga pagsenyas permanente nga nakaapekto sa actin cytoskeleton, ang epekto sa porma sa cell gitino sa mga pagbag-o sa tensyon nga gipahinabo sa mga pagbag-o sa densidad ug organisasyon sa mga sentral nga actin fibers.Sa mga selula sa U2OS, gigamit lang namo ang mga pagbag-o sa porma sa selula isip usa ka timaan sa SPECC1L nga kulang sa AJ nga pagbag-o ug pagkaayo.Sa konklusyon, among gi-hypothesize nga ang pagdili sa AKT nga agianan sa kakulangan sa SPECC1L nagdugang sa kalig-on sa AJ ug nagpamenos sa delamination sa CNCC.
Makapainteres, ang mga lebel sa pan-AKT mikunhod sa vitro ug sa vivo dugang sa phosphorylated 473-AKT nga lebel sa pagkawala sa SPECC1L, nga nagsugyot sa regulasyon sa PI3K-AKT signaling sa lebel sa AKT protein stability o turnover.Ang SPECC1L ug MID1 nga mga gene, parehong nalangkit sa Opitz/GBBB syndrome, nag-encode sa mga protina nga nagpalig-on sa microtubule 18,22.Ang mekanismo diin ang SPECC1L ug MID1 nagpataliwala sa microtubule stabilization dili hingpit nga masabtan.Sa kaso sa SPECC1L, kini nga pagpalig-on naglakip sa gipauswag nga acetylation sa usa ka subset sa microtubule 18.Posible nga ang SPECC1L naggamit ug susamang mekanismo aron mapalig-on ang ubang mga protina sama sa AKT.Gipakita nga ang acetylation sa lysine residues sa AKT nga protina nagdala ngadto sa pagkunhod sa localization sa lamad ug phosphorylation38.Dugang pa, ang ubiquitination sa K63 chain sa parehas nga lysine residue sa AKT gikinahanglan alang sa localization ug activation sa lamad niini39,40.Lakip sa daghang mga hinungdan nga nakig-uban sa mga protina sa SPECC1L nga giila sa lainlaing mga high throughput yeast two-hybrid screens, upat - CCDC841, ECM2942, APC ug UBE2I43 - nalambigit sa pagbalhin sa protina o kalig-on pinaagi sa ubiquitination o sumoylation.Ang SPECC1L mahimong maapil sa post-translational modification sa AKT lysine residues, nga makaapekto sa AKT stability.Bisan pa, ang kritikal nga papel sa SPECC1L sa lokalisasyon ug kalig-on sa protina sa AKT nagpabilin nga gipatin-aw.
Ang grabe nga mga depekto sa SPECC1L nga ekspresyon sa vivo miresulta sa pagtaas sa AJ marker staining ug depekto nga overlay sa CNCC, ingon man usab sa pagdugang sa apoptosis ug sayo nga embryonic lethality.Gipakita sa miaging mga taho nga ang mga mutant sa mouse nga adunay pagtaas sa lebel sa apoptosis adunay kalabotan sa mga depekto sa neural tube 44,45,46,47 ug mga depekto sa craniofacial48.Gisugyot nga ang sobra nga pagkamatay sa selyula sa neural folds o pharyngeal arches mahimong moresulta sa dili igo nga gidaghanon sa mga selyula nga gikinahanglan alang sa husto nga paglihok sa morphogenetic 48,49,50.Sa kasukwahi, ang among SPECC1L kulang nga mga linya sa cell nga adunay kasarangan nga pagkunhod sa SPECC1L nga ekspresyon nagpakita lamang sa mga pagbag-o sa AJ nga wala’y ebidensya sa pagtaas sa pagkamatay sa cell.Bisan pa, ang pagdili sa kemikal sa PI3K-AKT nga agianan sa kini nga mga selula sa Kd miresulta sa pagtaas sa apoptosis.Sa ingon, ang kasarangan nga pagkunhod sa ekspresyon o function sa SPECC1L nagsiguro nga mabuhi ang cell.Kini nahiuyon sa obserbasyon nga talagsaon nga Specc11 mutant embryo nga nakaikyas sa pagdakop sa st.Ang E9.5—tingali tungod sa pagkunhod sa gene capture efficiency—makasira sa ilang mga neural tubes ug mohunong sa ulahi sa pag-uswag, kasagaran adunay mga depekto sa craniofacial (Fig. S3).Nahiuyon usab niini ang talagsa nga panghitabo sa mga heterozygous Specc1l nga embryo nga adunay mga abnormalidad sa craniofacial-tingali tungod sa pagtaas sa kahusayan sa pagdakop sa gene-ingon man ang pagpangita sa zebrafish diin ang usa sa duha nga mga orthologue sa SPECC1L (specc1lb) hinungdan sa ulahi nga embryonic phenotypes, lakip ang pagkawala sa ubos nga apapangig ug bilateral clefts51.Busa, ang heterozygous SPECC1L loss-of-function mutations nga giila sa mga pasyente sa tawo mahimong hinungdan sa gagmay nga mga kapansanan sa SPECC1L function sa panahon sa craniofacial morphogenesis, igo aron ipatin-aw ang ilang orofacial clefts.Ang SPECC1L-based nga regulasyon sa intercellular contacts mahimo usab nga adunay papel sa palatogenesis ug fusion sa pharyngeal arches.Ang dugang nga mga pagtuon sa function sa SPECC1L makatabang sa pagpatin-aw sa papel sa temporaryo nga intercellular contact sa CNCC atol sa pagsira sa neural tube sa neuroepithelial cell motility ug craniofacial morphogenesis.
Ang U2OS osteosarcoma control ug SPECC1L-kd cells gihulagway na kaniadto (Saadi et al., 2011).Ang mga antibodies batok sa SPECC1L gihulagway usab kaniadto (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin antibodies (rabbit; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mouse; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. ), MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cleaved caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ug β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) gigamit sama sa gihulagway..Ang mga filament sa actin nabulit sa Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Ang U2OS control cells ug SPECC1L-kd cells gi-culture sa standard high glucose DMEM nga gidugangan og 10% fetal bovine serum (Life Technologies, Carlsbad, CA).Alang sa mga pagbag-o sa AJ, ang 2 x 105 nga mga selula gisabwag sa bildo nga gitambalan sa 0.1% nga porcine gelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ug giobserbahan alang sa mga kausaban sa porma sa selula.Ang mga selyula gikolekta sa lain-laing gipakita nga mga punto sa oras: 4 ka oras human sa pagpugas (t = 1), 24 ka oras human sa pagpugas (t = 2), paghugpong nga walay kausaban sa porma sa selula (t = 3), pagbag-o sa porma sa selula (t = 4) , 24 ka oras human sa kausaban sa porma sa selula (t = 5) ug 48 ka oras human sa kausaban sa porma sa selula (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Aron mabag-o ang agianan sa PI3K-AKT, ang mga selyula gikultura sa gipakita nga konsentrasyon sa PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) o SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Ang medium nga adunay mga kemikal giusab kada adlaw.
Ang mga rekording sa frame-by-frame gihimo sa live control ug KD nga mga selula ubos sa normal nga kondisyon sa kultura, ug ang mga hulagway sa kalainan sa hugna gikolekta matag 10 ka minuto sulod sa 7 ka adlaw.Nakuha ang mga hulagway gamit ang computer-controlled Leica DM IRB inverted microscope nga adunay mekanikal nga stage ug 10 × N-PLAN nga tumong nga konektado sa QImaging Retiga-SRV camera.Atol sa imaging, ang mga kultura sa cell gipadayon sa 37 ° C sa usa ka humid nga atmospera nga adunay 5% CO2.
Duha ka gene trap ES cell lines DTM096 ug RRH048 gikan sa Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) ang gigamit sa pagmugna og Specc11 deficient nga mga linya sa mouse, gitudlo nga Specc1lgtDTM096 ug Specc1lgtRRH046.Sa mubo, 129 / REJ ES nga mga selula ang gi-injected sa C57BL6 blastocysts.Ang resulta nga chimeric nga laki nga mga ilaga gipasanay sa babaye nga C57BL6 nga mga ilaga aron mailhan ang mga anak nga adunay kolor nga agouti coat.Ang presensya sa gene trap vector inserts gigamit sa pag-ila sa mga heterozygotes.Ang mga ilaga gitipigan sa nagkasagol nga background sa 129/REJ;C57BL6.Ang lokasyon sa insertion site sa genetic trap vector gikumpirma sa RT-PCR, genome sequencing, ug genetic complementation (Supplementary Figure 1).Aron masubay ang linya sa CNCC sa doble nga heterozygous Specc1lGT nga mga ilaga, ROSAmTmG (#007576) ug Wnt1-Cre (#003829) nga mga ilaga (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) gitabok aron makagama ang ROSAmTmG ug Wnt1-Cre allele sa Specc1os mutant.Ang tanan nga mga eksperimento sa mga ilaga gihimo sumala sa mga protocol nga gi-aprobahan sa Institutional Animal Care and Use Committee sa University of Kansas Medical Center.
Ang mga embryo gitakda sa (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) sulod sa 60 min sa temperatura sa lawak.Human sa fixation sa X-gal staining solution (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Ang pag-uswag sa mantsa gihimo sa 37 ° C .°C sulod sa 1-6 ka oras.Ang mga embryo gi-post-fixed sa 4% PFA ug gitan-aw.
Alang sa Western blotting, ang mga selula gi-lysed sa passive lysis buffer (Promega, Fitchburg, WI) nga gidugangan sa usa ka sinagol nga HALT protease inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Ang mga lysate giproseso sa 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX nga andam nga mga gel (Bio-Rad, Hercules, CA) ug gibalhin sa Immobilon PVDF membranes (EMD Millipore, Billerica, MA).Ang mga lamad gibabagan sa 5% nga gatas sa PBS nga adunay 0.1% Tween.Ang mga antibodies gilumlum sa tibuok gabii sa 4 ° C o sulod sa usa ka oras sa temperatura sa lawak.Ang Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) gigamit alang sa paghimo og signal.Alang sa immunostaining, ang mga embryo gitakda sa tibuok gabii sa 4% PFA/PBS ug cryopreserved.Ang mga cryosection sa tisyu gibabagan sa PBS nga adunay 1% nga normal nga serum sa kanding (Thermo Scientific, Waltham, MA) ug 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ug dayon gilumlom sa 4 ° C sa usa ka incubator sa panahon sa gabii.nga adunay anti-antibody ug fluorescent secondary antibody (1:1000) sulod sa 1 ka oras sa 4°C.Ang mga stained section gibutang sa ProLong gold medium (Thermo Scientific, Waltham MA) ug ang mga flat nga imahe nakuha gamit ang Leica TCS SPE confocal microscope.Ang matag immunostaining gihimo isip tulo ka independenteng mga eksperimento sa mga cirossection sa labing menos duha ka mutant nga embryo.Gipakita ang usa ka representante nga eksperimento.
Ang mga selula gilumlom sa giusab nga RIPA buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, ug HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Sa laktod, ang mga lysate gi-prepurified sa protina G magnetic beads (Life Technologies, Carlsbad, CA) ug dayon gilumlom sa tibuok gabii sa 4 ° C. nga adunay anti-SPECC1L o IgG protein G protein beads gigamit sa pagkuha sa SPECC1L ug Western blotting gihimo gamit ang anti -β-catenin antibody nga gihulagway sa ibabaw Ang co-IP nga mga eksperimento nga gipakita maoy representante sa upat ka independenteng mga eksperimento.
Ang mga naayo nga kultura nga mga selula o mga tisyu sa embryonic sa mouse gihatag sa sentro sa mikroskopya sa elektron sa University of Kansas Medical Center.Sa laktud, ang mga sample gi-embed sa EMbed 812 resin (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerized sa tibuok gabii sa 60 ° C, ug gibahin sa 80 nm gamit ang Leica UC7 ultramicrotome nga adunay sulud nga diamante.Ang mga seksyon gitan-aw gamit ang JEOL JEM-1400 transmission electron microscope nga adunay 100 kV Lab6 nga pusil.
Giunsa pagkutlo kining artikuloha: Wilson, NR et al.Ang kakulangan sa SPECC1L nagdala ngadto sa dugang nga kalig-on sa mga spliced ​​joints ug pagkunhod sa delamination sa cranial neural crest cells.ang siyensya.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induction ug pagkalahi sa neural crest.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR ug uban pa.Cranial neural crest cells sa paglihok: ang ilang papel sa craniofacial development.American Journal of Medical Genetics.Bahin A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: ang pagtubo ug paglambo niini sulod sa 20 ka tuig.Pediatrician.patolohiya.laboratoryo.tambal.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU ug Noten MM Breakthrough sa genetics sa orofacial clefts.Trends sa Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. ug Riley, FM Molecular nga mga mekanismo sa cranial neural crest cell migration ug patterning atol sa craniofacial development.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH ug Murray, JK Cleft nga ngabil ug alingagngag: pagsabut sa genetic ug environmental nga mga impluwensya.natural nga komento.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Abnormal nga morphogenesis sa panit, limbs, ug craniofacial nga rehiyon sa interferon-regulating factor-6 (Irf6) -kulang nga mga ilaga.Nasyonal nga Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Ang dominanteng mutasyon sa GRHL3 maoy hinungdan sa van der Waord syndrome ug nakadaot sa paglambo sa oral periderm.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ug Juriloff, DM Pag-update sa lista sa mga mutant sa mouse nga adunay mga depekto sa pagsira sa neural tube ug pag-uswag padulong sa usa ka kompleto nga genetic nga pagsabut sa pagsira sa neural tube.Pagsusi sa mga depekto sa pagkatawo.Bahin A, Clinical ug Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling nag-regulate sa survival ug proliferation sa skeletal development pinaagi sa p53-dependent intracellular pathway.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND ug Murdoch, JN Disheveled: Relasyon sa convergent nga pagpalapad sa neural tube closure.Mga uso sa neurolohiya.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).