347 stainless steel coiled tubing kemikal nga sangkap, Pag-ila sa nobela interferon-responsive human leukocyte antigen-A (HLA-A) chaperone nga mga protina gamit ang cross-linked mass spectrometry (CLMS)

Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Naggamit ka usa ka bersyon sa browser nga adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, gipakita namon ang site nga wala’y mga istilo ug JavaScript.
Ang mga slider nga nagpakita sa tulo ka mga artikulo matag slide.Gamita ang likod ug sunod nga mga buton sa paglihok sa mga slide, o ang slide controller nga mga buton sa katapusan aron sa paglihok sa matag slide.

Deskripsyon sa Produkto

Stainless Steel 347L Coil Tubes, Steel Grade: SS347L

Ang interferon signaling system nag-aghat sa usa ka lig-on nga cytokine nga tubag sa usa ka halapad nga mga pathogenic ug intrinsic pathological signal gikan sa palibot, nga miresulta sa induction sa mga subset sa interferon-inducible nga mga protina.Nag-apply kami sa DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) aron mahibal-an ang bag-ong mga interaksyon sa protina-protein sa domain sa mga protina nga gipahinabo sa interferon.Dugang pa sa gipaabot nga interferon-inducible nga mga protina, giila usab namo ang nobela nga intermolecular ug intramolecular nga cross-linked nga mga adduct sa canonical interferon-inducible nga mga protina sama sa MX1, USP18, OAS3, ug STAT1.Nagtutok kami sa orthogonal validation sa usa ka nobela nga set sa interferon-inducible protein network nga naporma sa HLA-A proteins (H2BFS-HLA-A-HMGA1) gamit ang co-immunoprecipitation ug ilang dugang nga pagtuon gamit ang molecular dynamics modeling.Ang pagmodelo sa conformational dynamics sa protina complex nagpadayag sa daghang mga interaksiyon nga mga site nga nagpakita sa mga interaksyon nga giila sa CLMS findings.Mag-uban, among gipresentar ang usa ka pilot nga pagtuon sa CLMS aron mahibal-an ang mga bag-ong mga komplikado sa pagsenyas nga naaghat sa interferon, ug nagpaabut sa mas lapad nga paggamit sa CLMS aron mahibal-an ang bag-ong dinamika sa mga interaksyon sa protina sa tumor microenvironment.
Sa wala pa magsugod ang usa ka adaptive immune response, ang natural nga sistema sa depensa sa host nagbutang usa ka antimicrobial nga tubag nga gipataliwad-an sa usa ka pamilya nga gitago nga alpha-helical cytokine nga gitawag nga interferon (IFNs).Ang tipo nga I IFN nga mga klase nga IFNα ug IFNβ nagpalihok sa mga tubag sa cellular, lakip ang antiviral, proapoptotic, proinflammatory, ug antiproliferative nga mga estado.Sa mga tawo, nahibal-an ang 13 nga mga subtypes sa IFNα, ang tanan nahugpong sa chromosome 91. Katingad-an, ang IFNα2 lamang ang gitun-an alang sa klinikal nga paggamit.Bag-ohay lang, ang espesyal nga atensyon gihatag sa panukiduki sa ubang mga subtype sa IFNα.Ang usa ka bag-o nga pagtuon nagpakita nga ang IFNα14 usa sa labing epektibo nga isoform sa pagpugong sa HBV2 ug HIV-13,4 nga replikasyon kumpara sa canonical IFNα2 subtype.
Na-establisar nga ang gi-activate nga type I interferon receptor complexes (IFNAR1 ug IFNAR2) nagpahinabo sa usa ka signal transduction cascade nga gipataliwad-an sa Janus kinases TYK2 ug JAK15,6.Kini nga mga Janus kinases phosphorylate signal transducers ug transcriptional protein activators (STAT1 ug STAT2) sa tyrosine residues aron masugdan ang SH2 domain-mediated heterodimerization6.Pagkahuman, ang IRF9 nagbugkos sa STAT heterodimer aron maporma ang usa ka trimeric complex sa IFN-stimulated factor 3 gene (ISGF3), nga nagbalhin sa nucleus ug nag-aghat sa transkripsyon sa kapin sa 2000 nga interferon-stimulated genes (ISGs) 5,6,7,8.
Ang mga ISG nagporma sa backbone sa natural nga immune system, labi na sa pagtubag sa pag-atake sa virus.Ingon usa ka una nga linya sa depensa batok sa impeksyon sa virus, ang mga selyula paspas nga nagpakaylap sa daghang mga interaksyon sa mga protina sa cellular nga adunay daghang mga kalihokan sa biolohikal.Kini nga mga protina naglakip sa pattern recognition receptors, signaling molecules, transcription factor, ug mga protina nga adunay direkta nga antiviral functions, ingon man negatibo nga regulators sa immune response9.Kadaghanan sa impormasyon sa kalihokan sa ISG nagagikan sa mga functional screen gamit ang overexpression screens10,11 o gene silencing techniques (siRNA, RNAi ug CRISPR)12,13 diin ang indibidwal nga ISGs gipahayag o gipugngan ug ang ilang kalihokan gisulayan sa lain-laing mga virus.Bisan kung kini nga mga pagtuon nagtino sa mga antiviral nga kabtangan sa indibidwal nga mga ISG, ang nagpahiping mga mekanismo sa molekula sa matag ISG nagpabilin nga wala mailhi.Gidawat sa kadaghanan nga daghang mga protina ang nakig-uban sa usa o daghang mga cytokine aron masiguro ang tibuuk nga kalihokan, busa ang mga ISG direkta nga nakig-uban o ang ilang mga interaksyon gipataliwala sa mga protina sa cellular.Pananglitan, ang usa ka bag-o nga photocrosslinked proteomics nga pagtuon nag-ila sa ATPase VCP/p97 isip usa ka mayor nga IFITM3 interaction partner, kansang pagdili mosangpot sa mga depekto sa lysosomal sorting, turnover, ug cotransport sa IFITM3 nga adunay viral particle 14.Pinaagi sa paggamit sa immunoprecipitation, among giila ang VAPA, usa ka vesicle-associated protein, isip usa ka interaction partner sa IFITM1/2/3 nga nagpataliwala sa cholesterol-mediated viral maturation, ug kini gipamatud-an sa laing pagtuon gamit ang yeast two-hybrid system.Scientific Support 15 , 16 .
Usa ka sukaranan nga proseso sa biolohikal nga nalambigit sa pagsumpo sa impeksyon ug malignant nga pagbag-o mao ang presentasyon sa antigen, nga gipataliwala sa mga dagkong molekula sa histocompatibility complex (MHC).Ang mga peptide (8-12 nga amino acid ang gitas-on) gikan sa mga giputol, wala'y panahon nga natapos o nasayop nga mga protina gikarga ngadto sa MHC-I heterodimer (nga gilangkoban sa MHC-I nga bug-at ug gaan nga mga kadena, nga gitawag ug β-2-microglobulin; β2M) 17,18.Ang resulta nga lig-on nga mga trimer sa MHC-I gidala ngadto sa ibabaw sa selula, diin ilang gipresentar ang intracellular peptides ngadto sa CD8+ T cells (cytotoxic T cells)17.Ang mga T cell makaila ug makaguba niini nga mga pathogen ug mga selula nga nagdala ug antigen nga espesipiko sa tumor.Tungod niini, ang mga pathogen ug mga selula sa tumor kanunay nga nagpugong sa proseso sa pagpakita sa antigen aron malikayan ang pag-monitor sa resistensya.Dugang pa, ang MHC-I gipaubos sa regulasyon sa 40-90% sa mga hubag sa tawo ug kanunay nga nalangkit sa usa ka dili maayo nga prognosis19.
Ang mga gene nga nalambigit sa pagtubag sa mga pathogens kinahanglan nga dali nga mobalhin tali sa usa ka kahimtang sa pagpahulay ug usa ka kahimtang sa aktibo nga transkripsyon.Busa, ubay-ubay nga mga cellular nga protina ang gipanghimatuud nga nalangkit sa pagtubag sa taas nga panginahanglan sa IFN sulod sa mubo nga mga panahon, lakip ang pagbag-o ug pagbag-o sa promoter nga chromatin 20,21.Kadaghanan sa mga pagtuon nagpunting sa pag-ila sa indibidwal nga mga kasosyo sa protina sa ISG sa presensya sa IFN.Daghang proteomic ug transcriptomic nga mga pagtuon sa modelo nga mga sistema sa selula ang nagpatin-aw sa epekto sa IFN sa cellular landscape.Bisan pa, bisan pa sa nagkadako nga pagsabut sa mga dinamikong gipahinabo sa mga interferon, gamay ra gihapon ang among nahibal-an bahin sa pagkalambigit sa mga ISG.Kung gikonsiderar ang pagkakomplikado ug ang mga dinamikong nagsalig sa oras sa interferon signaling, duha ka pangutana ang motungha: (i) posible ba nga ma-stabilize ug mabitik ang mga komplikado nga multiprotein nga nalambigit sa paspas nga pagsenyas, ug (ii) mahimo ba kini nga mga interaksyon nga mapa sa 3D nga wanang?
Aron matubag kini nga mga isyu, gipatuman namo ang disuccinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) inubanan sa mass spectrometry (CLMS) aron tun-an ang IFNα-induced protein interaction network ug ang dynamics niini.Ang DSS nagdugang sa covalent bonds tali sa proximal residues sa mga protina ug/o mga complex sa protina sa vivo.Ang sunod nga pag-analisar sa MS nagpadayag sa piho nga mga crosslinking nga mga site nga nagpakita sa spatial nga kaduol sa mga rehiyon sulod sa usa ka partikular nga protina, gitawag nga internal linkages, o mga subunit sa mga complex sa protina, nga gitawag og interrelationships.Gamit kini nga pamaagi, nahibal-an namon ang daghang mga nobela nga protina-protein nga mga komplikado ingon man ang interferon-induced multiprotein nga mga interaksyon nga network.Pinaagi sa dugang nga pagsulay sa usa ka subset niining bag-ong mga interaksyon, among gipakita nga ang H2BFS (H2B histone-type nga FS; human niini gitawag nga H2B) ug MDN1 naglihok isip binding partners alang sa HLA-A.
Ang Flo-1 nga mga selula usa sa labing nailhan nga in vitro nga mga modelo sa esophageal adenocarcinoma samtang gisundog nila ang mga hinungdan nga bahin sa esophageal tumors22,23.Bisan pa, dili tanan nga mga tumor immunogenic, ug aron mahibal-an kung ang mga selula sa Flo-1 motubag sa pagtambal sa interferon, gitambalan namon ang mga selula sa Flo-1 nga adunay 10 ng / ml IFNα sulod sa 72 ka oras.Ang Flo-1 nga mga selula nagpakita sa sayo nga induction sa pSTAT1 ug IRF1, sugod sa 2 nga mga oras human sa pagtambal ug nagpadayon sa 72 ka oras, nga adunay usa ka pagkunhod sa panahon nga nagsalig sa mga lebel sa IRF1 (Figure 1A).Ang mga ISG (MX1, IFITM1, OAS1 / 2, ug ISG15) nakit-an nga kusog nga naaghat pagkahuman sa mga oras nga 6, nga gisundog ang klasiko nga tunga-tunga ug ulahing bahin nga mga tubag sa IFNα (Figure 1A).Sa tingub, kini nga mga datos nagsugyot nga kini nga cellular nga modelo mahimong magamit sa pagtuon sa mga tubag sa interferon.
Nagkalainlain nga mga tubag sa ekspresyon sa protina sa mga selula sa Flo-1 pagkahuman sa pagtambal sa IFNα.(A) Ang ekspresyon sa protina sa Flo-1 nga mga selula nga gitambalan sa 10 ng / ml IFNα alang sa 2, 6, 24, 48 ug 72 nga mga oras gisusi sa immunoblot gamit ang gipakita nga ISG antibodies.(B) Coomassie blue stained SDS-PAGE gels sa tibuok cell extracts human sa cross-linking uban sa DSS alang sa gipakita nga mga oras ug konsentrasyon.(C) Representante nga immunoblot gisusi gamit ang p53(DO-1) nga antibody gikan sa parehas nga mga sample aron masusi ang lebel sa cross-linking sa protina.
Aron makuha ang in-situ nga interaksyon sa protina nga talan-awon, gigamit namo ang DSS, usa ka kaylap nga gigamit nga ahente sa cross-linking tungod sa taas nga permeability sa lamad niini ug medyo mubo nga oras sa reaksyon.Ang mas mubo nga oras sa reaksyon makatabang sa pagpugong sa pagporma sa dagkong mga aggregate sa crosslinked nga mga protina, sa ingon nagmintinar sa kalig-on sa crosslinker.Aron mahibal-an ang kamalaumon nga konsentrasyon sa DSS ug malikayan ang over-crosslinking, una namon nga gibutyag ang mga selyula sa 5, 2.5, ug 1 mM DSS alang sa 5, 10, 5, ug 30 minuto, matag usa, ug gisusi ang mga lysates sa Coomassie-stained SDS-PAGE (wala gipakita ang datos).Ang mga cell lysate makita nga hilabihan ka cross-link sa pinakaubos nga konsentrasyon ug sa pinakamubo nga punto sa panahon.Busa, ang DSS gi-titrate ngadto sa 1, 0.5, ug 0.1 mM sulod sa 5 minutos (Figure 1B).Ang labing maayo nga crosslinking naobserbahan sa 0.5 mM DSS sa 5 minuto, ug kini nga mga kondisyon gipili alang sa mga selula nga gitambalan sa IFNα.Dugang pa, ang Figure 1C nagpakita sa usa ka Western blot nga gihimo gamit ang p53 (DO-1) antibody aron masusi ang lebel sa cross-linking sa protina.
Ang Flo-1 nga mga selula gitambalan sa 10 ng/ml IFNα sulod sa 24 ka oras sa wala pa idugang ang crosslinker.Ang cross-linked nga mga selula sa sunod nga lysed pinaagi sa duha ka-lakang proteolysis ug mga protina giproseso sa FASP (Fig. 2)24,25.Ang cross-linked tryptic peptides gisusi pinaagi sa mass spectrometry (Fig. 2).Ang MS / MS spectra unya gipares sa pagkasunod-sunod sa protina ug gi-quantified sa MaxQuant26,27.Ang cross-linked peptides giila gikan sa nakuha nga spectra gamit ang SIM-XL nga programa, ug ang indibidwal nga mga compound gihiusa ngadto sa usa ka komplikadong network gamit ang xQuest28 ug SIM-XL29 open source computing software pipelines (Fig. 2).Giila sa SIM-XL ang mga interaksyon sa protina-protina, internal nga kadena ug indibidwal nga kadena sa yano o komplikado nga mga sagol nga protina ug naghatag mga script alang sa paghanduraw sa mga interaksyon sa mga istruktura sa protina.Dugang pa, giranggo niini ang matag cross-reference isip usa ka marka sa ID sumala sa kalidad sa spectrum sa MS/MS29.Daghang kasaligan nga mga interaksyon sa protina-protina ug mga komplikado ang nahibal-an, ug usa ka bag-ong hugpong sa mga interaksyon ang dugang nga gisusi gamit ang co-immunoprecipitation ug mga pagbag-o sa conformational sa mga komplikado gamit ang molecular dynamics (MD) modeling (Fig. 2) 30, 31.
Schematic overview sa pamaagi sa CLMS.Ang Flo-1 nga mga selula gitambalan sa 10 ng/ml IFNα sulod sa 24 ka oras nga gisundan sa in situ protein cross-linking gamit ang DSS nga gisundan sa cell lysis ug trypsinization.Ang cross-linked nga mga sample gisusi gamit ang Orbitrap mass spectrometer ug dugang nga sample alang sa fragmentation sa peptide precursors atol sa LC-MS/MS.Duha ka nalambigit nga peptide ang giila gikan sa nakuha nga spectra gamit ang Spectrum Recognition Machine sa Crosslinked Peptides (SIM-XL) nga programa, ug ang tanan nga mga compound gihiusa ngadto sa usa ka komplikadong network gamit ang computational pipelines.I-filter ang ubos nga pagsalig nga mga interaksyon base sa bakak nga positibo nga rate (FDR) nga mga marka.Daghang bag-ong high-fidelity nga mga interaksyon sa protina-protina ang dugang nga nakumpirma gamit ang co-immunoprecipitation, ug ang mga pagbag-o sa conformational sa mga komplikado gisusi gamit ang molecular dynamics (MD) modeling.
Usa ka kinatibuk-an nga ~ 30,500 ug ~ 28,500 nga mga peptide ang nakit-an gamit ang MaxQuant sa wala gipalihok ug gipukaw nga mga sample sa IFNα, matag usa (Supplementary Table S1, Fig. 3A).Ang pag-apod-apod sa gitas-on sa peptide sa duha ka mga kaso nagpakita sa usa ka mas taas nga proporsiyon sa mas dagkong mga peptide, nga nagpakita sa presensya sa mga cross-linked peptides (Fig. 3B, C).Dugang pa, ang usa ka mas dako nga proporsiyon sa mas dagkong peptides anaa sa 40-55 range sa IFNα-treated samples (Fig. 3C).Ang pagmapa sa protina batok sa log2 intensity nagpakita nga ang mga classic nga interferon-stimulated nga mga protina mao ang labing daghan kon itandi sa wala matambalan nga mga sample, lakip ang MX1, IFIT1 / 3, OAS2 / 3, DDX58, ug HLA-F (Figure 3D).Ang pag-analisa sa mga agianan alang sa mga protina labaw pa sa tulo ka pilo nga gipadato agig tubag sa pagtambal sa IFNα gamit ang database sa Reactome pathway nagpakita nga ang presentasyon ug pagproseso sa antigen nga MHC-I-mediated mao ang labing dominanteng agianan (Figure 3E).Nahiuyon sa nauna nga mga taho, ang mga tubag sa antiviral nga gipataliwala sa OAS ug ISG15 ingon man ang IFNα / β ug cytokine signaling usa sa mga agianan nga gi-aktibo.Dugang pa, ang lysine- ug serine-specific protein cross-links giila gikan sa orihinal nga nakuha nga MS / MS spectra gamit ang SIM-XL.Usa ka bag-o nga pagtuon nagreport sa 104 ka ISG nga naglangkob sa 20 nga mga virus gikan sa 9 nga mga klase sa virus pinaagi sa meta-analysis sa indibidwal nga mga pagtuon sa overexpression sa ISG sa 5 nga tipo sa cell9.Bisan pa, aron mabuntog ang mga limitasyon sa pagkalkula sa pag-screen sa dagkong mga dataset, nagsugod kami sa usa ka gamay nga dataset aron masusi ang posible nga mga interaksyon tali sa lista sa mga gene sa IRDS nga gitaho ni Padaria et al., kadaghanan niini mga ISG.
Pag-ila sa lahi nga gipahayag nga cross-linked nga mga protina isip tubag sa IFNα (data nga nakuha gikan sa MaxQuant).(A) Venn diagram nga nagrepresentar sa gidaghanon sa komon ug eksklusibong mga peptide nga giila sa IFNα14 nga gitambalan ug wala matambalan nga Flo-1 nga mga sample.Pag-apod-apod sa gitas-on sa peptide sa wala matambalan (B) ug IFNα nga gitambalan (C) nga mga sample nga gi-crosslink.(D) Heat map nga nagrepresentar sa log2 (LFQ intensity) tali sa wala matambalan ug IFNα14 nga gitambalan nga Flo-1 nga mga selula.Ang wala nga panel nagpakita sa mga protina nga labing aktibo nga gi-aktibo sa presensya sa IFNα.(E) Histogram nga nagrepresentar sa 20 ka dagkong mga agianan sa pagpalambo human sa pagtambal sa IFNα.Ang database sa Reactome pathway nag-analisar sa labaw pa sa upat ka pilo nga mga pagbag-o sa upregulated nga IFNα-responsive nga mga protina.
Ang interferon-mediated ISG stimulation maayo nga dokumentado, apan sa lebel sa molekula dili kaayo masabtan kung giunsa kini nga mga protina misangko sa usa ka halapad nga biolohikal nga mga gimbuhaton.Gisusi namon ang mga interaksyon sa protina nga adunay taas nga lebel sa pagsalig tali sa nahibal-an nga mga ISG.Makapainteres, nahibal-an namon ang usa ka network nga naglakip sa MX1, USP18, ROBO1, OAS3, ug STAT1 nga mga protina nga nahimong usa ka dako nga komplikado agig tubag sa pagtambal sa IFNα (Figure 4, Table S2) 32,33,34.Labing hinungdanon, kini nga mga interaksyon nakit-an sa tanan nga mga triplicate nga gitambalan sa IFNα ug wala makit-an sa wala matambalan nga mga sampol, nga nagsugyot nga kini naporma espesipiko agig tubag sa pagtambal sa IFNα.Nahibal-an nga ang STAT1 nga transkripsyon nag-regulate sa pagpahayag sa kini nga mga ISG, apan ang interaksyon niini sa mga ISG sa lebel sa protina wala pa gitun-an.Ang kristal nga istruktura sa STAT1 nagpakita nga ang helical domain (CCD) niini wala apil sa interaksyon sa DNA o mga protomer sa panahon sa pagporma sa mga dimer35.Kini nga mga α-helice nagporma og usa ka helical helix nga estraktura nga naghatag og usa ka nag-una nga hydrophilic surface area aron mahitabo ang mga interaksyon 35 .Sa among datos sa CLMS, among naobserbahan nga kadaghanan sa mga interaksyon sa STAT1 nahitabo sa SH2 domain nga nag-una sa CCD, ang linker domain, o ang C-terminal tail (residues 700-708) (Figure 4A).Ang usa ka miaging pagtuon nagtaho nga ang USP18 nagbugkos sa CCD ug DNA-binding domain (DBD) sa STAT2 ug gi-recruit sa subunit sa type I interferon receptor IFNAR2 aron sa pagpataliwala sa pagdili sa type I interferon signaling 24.Gipakita usab sa among datos nga ang USP18 catalytic domain nakig-uban sa STAT1 DBD (Figure 4A, D), nga nagsugyot nga ang STAT1 ug STAT2 mahimong adunay papel sa pagdani sa USP18 sa IFNAR2.
Protein-protein ISG network nga giila sa cross-linked cells nga gitambalan sa IFNα.(A) Ang laraw sa interaksyon sa 2D nga nagpakita sa mga interaksyon sa protina-protein (nahimo sa programa sa SIM-XL), nga adunay mga linya nga nagrepresentar sa intermolecular nga interaksyon (crosslink cutoff nga gitakda sa 3.5).Ang mga domain sa lain-laing mga identidad gimarkahan sa ilang kolor32: MX1 domain, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), ug GED (569–660).OAS3 nga mga dominyo: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), ug OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ug fn3 (777–864).Mga natad sa STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), ug STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Circular viewer sa cross-linked proteins (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, ug STAT1) nga adunay mga interaksyon ug interaksyon nga gimarkahan sa asul ug pula, matag usa.Ang cross-link threshold gitakda sa 3.5.Ang mga laraw sa tuldok nagpaila sa mga site sa interaksyon sa STAT1 nga adunay MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), ug OAS3 (F), ingon man mga site sa interaksyon sa K o S tali sa duha nga mga peptide.Sa numero, ang cross-link score threshold gitakda sa 3.0.(G) Nagkalainlain nga mga site sa interaksyon tali sa STAT1 ug OAS3 DI nga mga dominyo nga gipatong sa ilang mga istruktura sa protina sa PyMol (PyMOL molecular graphics system, bersyon 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) ug OAS3 (pdb id: 4s3n34).) programa.
Duha ka isoform sa USP18 ang gihulagway sa mga tawo, usa ka full-length nga protina nga kasagarang nahimutang sa nucleus, ug usa ka isoform nga walay N-terminal domain, USP18-sf, nga parehas nga giapod-apod sa cytoplasm ug nucleus 36 .Dugang pa, ang N-terminus gitagna nga dili matukod ug wala magkinahanglan og isopeptidase nga kalihokan o ISG1537 nga pagbugkos.Kadaghanan sa mga interaksyon nga giila sa among pagtuon nahimutang sa N-terminus sa protina, nga nagsugyot nga kini nga mga interaksyon naglakip sa full-length nga USP18 (Figure 4A, D) ug sa ingon lagmit mahitabo sa nucleus.Dugang pa, gipakita usab sa among datos nga ang N-terminus espesyal alang sa mga interaksyon sa protina-sa-protein.Ang IFNAR2 binding site nahimutang sa taliwala sa residues 312-368, ug ilabina, walay bisan usa sa mga protina sa complex nga nagbugkos niini nga rehiyon (Fig. 4A) 37,38.Kini nga mga datos nga gihiusa nagpakita nga ang IFNAR2 binding domain eksklusibo nga gigamit sa receptor protein.Dugang pa, ang OAS3 ug ROBO1 lamang ang nakit-an nga nalangkit sa mga domain sa ibabaw sa N-terminus ug IFNAR2 binding site (Figure 4A).
Ang ROBO1 iya sa immunoglobulin (Ig) superfamily sa transmembrane signaling molecules ug naglangkob sa lima ka Ig domains ug tulo ka fibronectin (Fn) domains sa extracellular region.Kini nga mga extracellular domain gisundan sa usa ka lamad-proximal nga rehiyon ug usa ka transmembrane helix 39. Ang usa ka unstructured intracellular nga rehiyon nahimutang sa C-terminus ug adunay gitipigan nga mga motif sa han-ay nga nagpataliwala sa effector protein binding39.Ang rehiyon gikan sa amino acids ~ 1100 ngadto sa 1600 kasagaran disordered.Among nakit-an nga ang MX1 nakig-uban sa ROBO1 pinaagi sa Ig, Fn, ug intracellular nga mga dominyo, samtang ang kadaghanan sa mga interaksyon sa STAT1 mahitabo tali sa iyang CCD, linker domain, ug ang C-terminus sa ROBO1 (Fig. 4A, E).Sa laing bahin, ang mga interaksyon sa DI, DIII, ug OAS3 linker nga mga rehiyon gipang-apod-apod sa tibuok ROBO1 nga protina (Fig. 4A).
Ang oligoadenylate synthase (OAS) nga pamilya sa protina modawat ug magbugkos sa intracellular double-stranded RNA (dsRNA), moagi sa conformational nga mga kausaban, ug mag-synthesize sa 2′,5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40.Nakaplagan nga taliwala sa tulo ka OASs, ang OAS3 nagpakita sa pinakataas nga affinity sa dsRNA ug nag-synthesize sa pinakagamay nga kantidad sa 2-5 As, nga maka-activate sa RNase L ug sa ingon limitahan ang viral replication 41.Ang pamilya sa OAS naglangkob sa polymerase beta (pol-β)-sama sa nucleotide transferase domain.Gipakita sa miaging panukiduki nga ang catalytic nga kalihokan sa C-terminal domain (DIII) nagsalig sa dsRNA-binding domain (DI), nga gikinahanglan alang sa pagpaaktibo sa OAS342.Naobserbahan namon nga ang DI ug DII nga mga domain sa OAS3 nakig-uban sa CCD ug usa ka gamay nga junction nga rehiyon tali sa SH2 ug STAT1 TAD (Figure 4A, F).Ang pag-overlay sa lainlaing mga crosslinking nga mga site sa istruktura sa protina nagpadayag sa usa ka interaksyon tali sa β-sheet ug DBD STAT1 loop ug usa ka bukas nga bulsa o lungag nga naporma sa mga nahabilin nga 60-75 sa DI domain sa OAS3 (Fig. 4G).Ang oryentasyon sa mga protina sa complex nagpakita usab nga walay bisan usa sa mga interaksyon sa OAS3 nga nakabalda sa abilidad sa pagbugkos sa DNA sa DI domain niini (Fig. S1A).Dugang pa, ang N-terminal nga domain sa GTPase MX1 nakig-uban sa mga domain sa DI ug DIII sa OAS3 (Fig. 4A).Naobserbahan usab namo ang usa ka interaksyon tali sa OAS1 ug MX1 sa tanang tulo ka IFNα-treated repeats, diin ang usa ka OAS1 domain (usab catalytically active) nakig-interact sa tanang tulo ka MX1 domains (Figure S2A, B).
Ang mga protina sa MX kabahin sa usa ka dako nga pamilya sa mga GTPase nga sama sa dynein nga adunay N-terminal GTPase domain nga nagbugkos ug nag-hydrolyze sa GTP, usa ka intermediate domain nga nagpataliwala sa self-assembly, ug usa ka C-terminal leucine zipper nga naglihok isip usa ka GTPase (LZ). ).domain effector domain25,43.Ang MX1 nagbugkos sa mga subunit sa viral polymerases aron babagan ang transkripsyon sa viral gene43.Ang usa ka kaniadto nga gitaho nga yeast two-hybrid screen nagpakita nga ang PIAS1-associated MX1 nagpugong sa STAT1-mediated gene activation pinaagi sa pagbabag sa DNA-binding activity ug usab adunay SUMO E344,45 ligase activity.Dinhi, gipakita namon nga ang MX1 nagbugkos sa STAT1 (Figure 4C, D), bisan pa kung giunsa kini nga interaksyon makaapekto sa STAT1-mediated gene activation agig tubag sa IFNα nanginahanglan dugang nga pagtuon.Dugang pa, nakit-an usab namo nga ang MX1 nakig-interact sa IFIT3 ug DDX60 sa tanang tulo ka IFNα-treated repeats (Fig. S2C).
Ang DDX60 usa ka IFN-induced cytoplasmic helicase nga kaniadto gitaho nga adunay papel sa RIG-I-independent nga pagkadaot sa viral RNA46.Kini nakig-uban sa RIG-I ug nagpalihok sa pagsenyas niini sa paagi nga espesipiko sa ligand 46. Ang DDX60 naglangkob sa usa ka DEXD/H-Box helicase domain ug usa ka C-terminal helicase domain nga nagbugkos sa viral RNA ug DNA47.Kadaghanan sa mga interaksyon niini sa MX1 ug IFIT3 mahitabo sulod sa taas nga N- ug C-terminal nga mga rehiyon nga walay canonical domain o motifs (Fig. S2E, F).Bisan pa, ang MX1 gilangkit usab sa DEXD / H-Box helicase domain (Fig. S2E).Ang mga protina sa pamilyang IFIT adunay tandem nga mga kopya sa usa ka lahi nga helix-turn-helix motif nga gitawag ug tetrapeptide repeat (TPR).Ang IFIT3 nakit-an nga usa ka positibo nga modulator sa pagsenyas sa RIG-I ug busa usa ka bahin sa MAVS complex.Gihiusa, ang among datos nagsugyot nga ang IFIT3 ug DDX60 nag-interact sa panguna sa rehiyon tali sa TPR 3-6 sa IFIT3 ug mahimong adunay papel sa RIG-I / MAVS signaling (Fig. S2F).
Tungod kay ang pag-screen sa tibuok proteome kay computationally intensive, among gi-screen ang tibuok database sa UniProt sa tawo para sa presensya sa usa sa IFNα-treated repeats.Sa kini nga replika, nakit-an namon ang daghang kasaligan nga mga network sa interaksyon alang sa HLA-A.Ang pagtuki sa mga agianan sa protina nga giila sa MS / MS spectra nagpakita nga ang MHC-I-based nga pagproseso sa antigen ug presentasyon mao ang nag-unang agianan nga gipahinabo sa interferon (Fig. 3D).Busa, naka-focus kami sa pagtuon sa mga interaksyon sa protina sa MHC-I nga mga molekula nga adunay taas nga lebel sa pagsalig sa tanan nga mga cross-linked sample.Ang HLA naglangkob sa α1, α2 ug α3 nga mga domain ug mga light chain, ug ang microglobulin β2 (β2m) usa ka kanunay nga chaperone protein49.Sa higayon nga mapundok sa endoplasmic reticulum, ang HLA dili lig-on sa pagkawala sa peptide ligands50.Ang peptide-binding groove naporma pinaagi sa highly polymorphic ug unstructured α1 ug α2 domains sa non-peptide form ug ang medyo dili kaayo polymorphic α351 domain.Sa presensya sa IFNα, nakit-an namo ang duha ka HLA-A complex: ang usa nakig-interact sa HMGA1 ug H2B (Figure 5, Table S3) ug ang usa nakig-interact sa MDN1, LRCH4 ug H2B (Figure 6).
Ang IFNα nag-aghat sa usa ka network sa interaksyon sa HLA-A nga adunay H2B (H2BFS) ug HMGA1.(A) 2D plot (namugna sa SIM-XL software) nga naghulagway sa lain-laing mga matang sa interaksyon sa H2B-HLA-A-HMGA1 complex: interlink (asul), interlink (pula) ug single link (itom)..Ang mga domain sa lain-laing identidad kay color coded32: H2B (histone; 2–102) ug MHC-I (MHC_1; 25–203, grupo C1; 210–290 ug MHC_I_C; 337–364).Ang cross-link threshold gitakda sa 3.5.Ang mga laraw sa tuldok nagpaila sa mga site sa interaksyon sa HLA-A nga adunay H2B (B) ug HMGA1 (C), ingon man ang mga site sa interaksyon sa K o S tali sa duha nga mga peptide.Sa numero, ang cross-link score threshold gitakda sa 3.0.(D) Mga relasyon tali sa mga protina nga gipakita sa mga istruktura sa H2B, HLA-A, ug HMGA1 nga mga protina sa programa sa PyMOL.Kini nga mga istruktura gi-modelo gamit ang Phyre2 server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ug ang template nga mga istruktura alang sa H2B, HLA-A ug HMGA1 nga mga protina mao ang 1kx552, 1kj349 ug 2eze55, matag usa.
Ang IFNα nag-aghat sa usa ka network sa interaksyon sa HLA-A nga adunay H2B (H2BFS), MDN1 ug LRCH4.(A) Intramolecular (pula) ug intermolecular (asul) nga mga crosslink nga gipresentar sa usa ka 2D interactive nga mapa (namugna sa SIM-XL software) nga adunay MDN1 nga girepresentahan isip usa ka lingin.Ang cross-link threshold gitakda sa 3.5.Ang mga domain sa lain-laing identidad kay color coded32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupo C1; 210–290 ug MHC_I_C; 337–364) ug LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) ug CH (535–641)).(B) Mga relasyon tali sa mga protina nga gipakita sa mga istruktura sa H2B, HLA-A, LRCH4, ug MDN1 nga mga protina sa programa sa PyMOL.Kini nga mga istruktura gi-modelo gamit ang Phyre2 server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) nga adunay template structures 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ug 6i2665 para sa H2B, HLA-A, LRCH4 ug MDN1 nga mga protina, matag usa.Dot plots nga nagpakita sa K o S interaction sites para sa HLA-A nga adunay H2B (C), LRCH4 (D), ug MDN1 (E).Alang sa mga laraw, ang cross-link score threshold gitakda sa 3.0.
Gawas pa sa pagpadayon sa integridad sa genome, ang histone H2B nalangkit usab sa regulasyon sa transkripsyon.Ang H2B nga protina naglangkob sa usa ka sentral nga histone domain (HFD) nga naporma sa tulo ka α-helice nga gibulag sa mga galong ug usa ka C-terminal nga ikog 41,52.Kadaghanan sa interaksyon sa H2B mahitabo sa α1 helix, nga naghatag og trimerization sa HFD heterodimer (Fig. 5A, B).Bisan tuod ang mga lysin nalangkit sa pagbugkos sa DNA, ang ubang mga lysin kay alternatibong acetylation o methylation sites usab.Pananglitan, ang mga residue K43, K46, ug K57 gikan sa H2B wala nalangkit sa direktang pagbugkos sa DNA, apan mga target sa nagkalain-laing post-transcriptional nga mga kausaban53.Sa susama, ang mga residue K44, K47, ug K57 sa H2B mahimong adunay usa ka alternatibo nga papel sa presensya sa IFNα, lakip ang mga interaksyon sa ubang mga protina (Fig. 5A, B).Dugang pa, ang extrachromosomal histone H2B nagpalihok sa immune response sa nagkalain-laing matang sa selula, nga naglihok isip cytosolic sensor aron makamatikod sa double-stranded DNA (dsDNA) nga mga tipik nga nakuha gikan sa makatakod nga mga ahente o nadaot nga mga selula54.Sa presensya sa mga virus sa DNA, ang pagkunhod sa H2B nagpugong sa produksiyon sa IFN-β ug STAT154 phosphorylation.Ang H2B nahibal-an usab nga mobalhin sa sulod ug gawas sa nucleus nga mas paspas kay sa ubang mga core histones54.Ang mga interaksyon sa H2B sa MDN1 ug LRCH4 naobserbahan usab sa mga pinili nga wala matambalan nga mga sample.Among nakita nga ang HLA-A nakig-interact sa H2B sa tanang tulo ka IFNα-treated samples ug sa usa ka untreated repeat sample.Kini nga mga datos nagpakita sa papel sa H2B sa usa ka alternatibong physiological function nga independente sa transcriptional regulation.
Ang HMGA1 (taas nga grupo sa paglihok nga AT-Hook 1), usa ka gamay nga nucleoprotein nga dato sa mga amino acid nga nagpasiugda sa sakit, nahibal-an kauban ang HLA-A.Kini adunay acidic nga C-terminal nga ikog ug tulo ka managlahi nga DBD nga gitawag ug AT hooks tungod kay kini nagbugkos sa menor de edad nga groove sa AT-rich nga rehiyon sa dsDNA55,56.Kini nga pagbugkos hinungdan sa pagduko o pagtul-id sa DNA, nga nagtugot sa mga hinungdan sa transkripsyon sa kanonikal nga maka-access sa pagkasunod-sunod nga konsensus niini.Ang ikog sa C-terminal gituohan nga nalambigit sa mga interaksyon sa protina-protina ug ang pagrekrut sa mga hinungdan sa transkripsyon, tungod kay ang mga mutant sa C-terminal nga pagtangtang dili makahimo sa pagsugod sa transkripsyon57.Dugang pa, kini nga domain naglangkob sa daghang gitipigan nga mga site sa phosphorylation nga nailhan nga mga substrate alang sa kinases 58.Among naobserbahan ang HLA-A ug H2B nga mga interaksyon sa HMGA1 sa gawas sa C-terminal domain, nga nagsugyot nga ang C-terminal domain kasagarang gigamit alang sa transcription factor binding (Fig. 5A, C).Ang mga protina sa HMGA nakigkompetensya sa histone H1 alang sa pagbugkos sa adapter DNA, sa ingon nagdugang ang pagka-access57.Sa susama, lagmit nga ang HMGA nakig-uban sa histone H2B ubay sa linker DNA sa kompetisyon sa histone H1.Ang HMGB1 nag-aghat sa pagpahayag sa HLA-A, -B, ug -C sa mga dendritic nga mga selula, nga mitultol sa ilang pagpaaktibo59, apan ang usa ka interaksyon tali sa HMG ug HLA wala pa gitaho kaniadto.Nakita namon nga ang HMGA1 nakig-uban sa α1 ug α3 nga mga domain sa HLA-A, nga kadaghanan sa mga interaksyon sa gawas sa 3 DBD (Figure 5A, C).Sa among mga kamot, ang HLA-A nakit-an nga na-localize sa nucleus (data nga wala gipakita), ug gihatagan nga ang H2B ug HMGA1 anaa usab sa nucleus, kini nga interaksyon lagmit mahitabo sa nucleus.Ang piho nga mga pagdugang nga gisukod tali sa H2B, HLA-A, ug HMGA1 gipakita sa Figure 5D.
Kadaghanan sa mga interaksyon sa HLA-A sa ubang mga protina mahitabo sulod sa iyang α1 ug α2 nga mga dominyo ug ang disordered C-terminal domain (Fig. 6).Sa usa niini nga mga pananglitan, among nakita nga ang HLA-A nakig-uban sa disordered N-terminal tail sa LRCH4 (Figure 6A, D).Ang LRCH4 nag-regulate sa TLR4 activation ug LPS cytokine induction, sa ingon modulating ang natural nga immune response60,61.Kini usa ka protina sa lamad nga adunay siyam ka leucine-rich repeats (LRRs) ug usa ka calmodulin (CH) homology motif sa ectodomain niini, nga gisundan sa usa ka transmembrane domain (TMD) 60, 62.Ang mga domain sa CH gikataho nga nagpataliwala sa mga interaksyon sa protina-protina 60.Ang usa ka bahin sa mga 300 ka amino acid tali sa LRR ug CH domains medyo dali makuha apan dili maayo.Base sa function sa disordered nga mga rehiyon isip mga tigpataliwala sa protina-protein network ug vesicular transport 63, among nakita nga kadaghanan sa mga interaksyon sa protina mahitabo sa disordered nga mga rehiyon.Ang mga interaksyon sa MDN1 giapod-apod sa tibuok nga gitas-on sa protina, lakip ang LRR1, LRR6, CH domains, ug random nga mga rehiyon, samtang ang H2B nag-una sa CH domain (Fig. 6A, B).Ilabi na, walay bisan usa sa mga interaksyon nga naglakip sa TMJ, nga nagsugyot sa espesipiko sa pamaagi sa CLMS (Figure 6A, B).
Ang MDN1 giila usab nga bahin sa HLA-A protein network (Figure 6A).Kini iya sa AAA nga pamilya sa mga protina (ATPases nga nakig-uban sa lain-laing mga kalihokan).Kini mao ang sama nga N-terminal AAA domain nga nag-organisar ngadto sa usa ka hexameric nga singsing ug nagtangtang sa assembly factor gikan sa 60S 64 ribosomal subunit.morag susama sa dynein64,65,66.Dugang pa, ang Asp/Glu rich region gisundan sa MIDAS domain (metal ion dependent site).Tungod sa dako nga gidak-on sa MDN1 (gibana-bana nga 5600 amino acids) ug ang limitado nga homology niini nga adunay maayo nga gitun-an nga mga protina, gamay ra ang nahibal-an bahin sa istruktura ug gimbuhaton niini sa mga tawo.Among giila ang HLA-A, H2B, ug LRCH4 isip MDN1 binding partners ug gipadayag ang ilang oryentasyon isip protina complexes sa PyMol (Fig. 6A,B).Kining tulo ka protina nakig-interact sa AAA domain, ang dynein-like linker domain, ug posibleng MIDAS MDN1 domain.Sa usa ka miaging report, ang affinity purification sa mga protina sa paon nagpaila sa MDN1 isip usa ka protina nga may kalabutan sa histone H2B67.Dugang pa, ang usa ka bag-o nga pagtuon usab nagtaho sa usa ka interaksyon tali sa MDN ug HLA-B sa HCT116 nga mga selula gamit ang affinity-purified mass spectrometry, nga nagsuporta sa among findings68.Ang pag-ila niini nga komplikado sa IFNα-treated samples nagsugyot og usa ka papel alang sa MDN1 sa interferon signaling.
Tungod kay ang HLA genes kay polymorphic kaayo, among gikuha ang sequencing reads nga nagmapa sa HLA-A, -B, ug -C gikan sa RNA sequencing data sa Flo-1 cells (data wala gipakita).Ang mga han-ay sa peptide nga nahiuyon sa pagsunud sa pagbasa nagpadayag mga hinungdanon nga kalainan tali sa HLA-A, -B, ug -C sa mga rehiyon diin ang mga cross-linked peptides nahimutang sa HLA-A (Figure S3).Dugang pa, wala namo naobserbahan ang protina-sa-protein nga cross-linking sa HLA-B/C nga mga molekula nga adunay H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 nga mga protina.Kini nagsugyot nga ang interaksyon sa protina nga nakit-an tali sa HLA-A, MDN1, LRCH1 ug HMGA1 mao ang HLA-A nga piho.Dugang pa, ang proteomic analysis sa mga non-crosslinked sample (Table S4) nagpakita nga ang HLA-A adunay mas taas nga sequence coverage kumpara sa HLA-B o HLA-C.Ang mga peptide nga giila alang sa HLA-A taas ang intensity sa parehas nga IFNα-treated ug wala matambalan nga mga sample.
Aron maseguro nga ang mga interaksyon nga giila dinhi dili tungod sa dili piho nga cross-linking sa duha ka mga protina sa duol nga spatial nga kaduol, dugang namon nga gikumpirma ang duha ka bag-ong HLA-A nga mga hinungdan nga nakig-uban pinaagi sa paghimo sa co-immunoprecipitation assays.Ang mga interaksyon sa HLA-A sa endogenous MDN1 ug H2B nakit-an sa parehas nga IFNα-treated ug wala matambalan nga Flo-1 nga mga selula (Figure 7, Figure S4).Gikumpirma namon nga ang HLA-A nakuha sa H2B sa mga immunoprecipitates ug nga kini nga asosasyon tungod sa pagtambal sa IFNα tungod kay ang HLA-A wala sa mga sample nga immunoprecipitate gikan sa wala matambalan nga mga selyula (Figure 7A).Bisan pa, ang among datos nagsugyot nga ang IFNα lahi nga nag-regulate sa HLA-A nga nagbugkos sa H2B ug MDN1.Ang IFNα nag-aghat sa panag-uban tali sa H2B ug HLA-A, apan gipakunhod ang pagpakig-uban niini sa MDN1.Nakita namon nga ang MDN1 nakig-uban sa HLA-A sa mga kontrol, ug ang pagdugang sa IFNα nakunhuran kini nga interaksyon nga independente sa MDN1 induction pinaagi sa IFNα (Figure 7B, C).Dugang pa, ang HLA-A immunoprecipitation nakuha ang H2B sa A549 nga mga selula (Fig. S4), nga nagsugyot nga kini nga interaksyon independente sa tipo sa selula.Gihiusa, kini nga mga resulta nagsuporta sa interferon-mediated nga mga interaksyon sa HLA-A sa H2B ug MDN1.
HLA-A co-purify H2B ug MDN1.Ang representatibo nga endogenous H2B (A) ug MDN1 (B) immunoblots ang immunoprecipitated gikan sa IFNα-treated Flo-1 nga mga selula ug gisusi alang sa gipakita nga mga antibodies.Ang mouse ug rabbit IgG gigamit isip negatibong kontrol.(C) Relatibo nga kantidad (input) sa lain-laing antigens gihulagway pinaagi sa immunoblots gisusi batok sa gipakita nga mga antibodies, β-actin gigamit ingon nga usa ka loading kontrol.
Ang structural properties sa usa sa interferon-induced highly reliable cross-linked networks, H2B-HLA-A-HMGA1, gisusi.Gigamit namo ang molecular dynamics modeling isip alternatibong pamaagi aron masabtan ang conformational dynamics sa mga protina nga nalambigit niini nga complex (Figure 8).Ang mga inferens gikan sa datos sa CLMS nagsugyot sa posibilidad sa lain-laing mga conformation sa H2B, HLA-A, ug HMGA1 nga mga protina.Busa, ang mosunod nga mga potensyal nga komplikado gimodelo sa usa ka solvent medium: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ug H2B-HLA-A-HMGA1.Usa ka inisyal nga protina-protein docking screen gamit ang MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) nga pakete nagsugyot sa posible nga mga conformation nga lahi sa taliwala niini nga mga protina (Fig. 8A).Ang pagtan-aw sa docking protein complex nagpadayag sa daghang mga interaksyon ug posible nga mga konpormasyon (Figure 5A, 8).Busa, ang usa ka posible nga conformation gipakita sa Figure 8A (nga adunay label nga mga cross-link) ug kini dugang nga gisusi gamit ang MD modeling pipeline.Dugang pa, ang pagbugkos sa H2B o HMGA1 ngadto sa HLA-A nagpasiugda sa mas taas nga affinity sa H2B alang sa HLA-A (Fig. 8A).
Conformational dynamics sa posible nga mga network tali sa H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, ug H2B-HLA-A-HMGA1 complexes.(A) Ang wala nga panel usa ka 2D nga mapa (nahimo sa SIM-XL software) sa intramolecular (pula) ug intermolecular (asul) nga mga crosslink (crosslink cutoff nga gitakda sa 3.5).Dugang pa, ang cross-linking residues nga giila gimarkahan sa mga istruktura sa H2B, HLA-A, ug HMGA1 nga mga protina.Ang mga kaubang konpormasyon niini nga mga protina gikuha gamit ang docking pipeline nga gipatuman sa MOE package.Ang ubos nga wala nga panel nagpakita sa nagkalain-laing posibleng conformation sa H2B-HLA-A ug HMGA1-HLA-A complex nga adunay lain-laing mga protina-protein binding affinities (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standard deviation (RMSD) sa atomic positions (walay labot ang hydrogen atoms) alang sa matag istruktura sa protina.(C) Intermolecular protein-protein hydrogen bond interaksyon gikan sa nagkalain-laing simulated complexes nga naghunahuna sa piho nga interaksyon sa gidugayon ≥ 10 ns.Ang h-bond donor-acceptor cutoff nga gilay-on gitakda sa 3.5 Å, ug ang donor-H-acceptor cutoff nga anggulo gitakda sa ≥ 160°–180°.(D) Gimarkahan nga mga residu nga nagporma sa HLA-A protein-protein nga mga interaksyon sa ilang tagsa-tagsa ka mga kauban, nga nagsangkad sa ≥ 20 ns, nga gikuha gikan sa dummy HLA-A-H2B ug HLA-A-HMGA1 complexes.Ang mga istruktura sa protina nagrepresentar sa kasagaran nga istruktura sa 100 ns MDS.(E) Interaksyon tali sa HLA-A-H2B ug HLA-A-HMGA1 complexes kumpara sa mga interaksyon nga gisubay sa H2B-HLA simulation sa 100 ns base sa K o S interaction site tali sa duha ka peptides.Mga Komplikado /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Ang kantidad sa threshold alang sa pagtimbang-timbang sa mga cross-link gitakda sa 3.0, ug ang mga piho nga interaksyon gikan sa MDS nga nagkuha ≥ 10 ns gikonsiderar.Ang mga istruktura sa protina gihulagway gamit ang BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) ug Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) nga mga pakete.
Ang kalig-on sa HLA-A nga mga molekula sa paglabay sa panahon (standard deviation; RMSD o standard deviation; RMSF) nagpakita nga ang presensya sa H2B o HMGA1 nga mga protina sa mga complex nagpalig-on sa HLA-A (Figure 8B, Figure S5).Ang protina sa HMGA1 hugot nga nagbugkos sa B2M site sa HLA-A, nga nag-aghat sa kalig-on sa HLA-A amino acids sa HLA-A-HMGA1 o H2B-HLA-A-HMGA1 complex (Figure 8B, Figure S5).sa partikular, HLA residues ~ 60-90 ug ~ 180-210 nakaplagan nga dili kaayo flexible sa atubangan sa H2B (FIG. 8B).Ang H2B ug HMGA1 nagpakita nga mas maayo nga pagbugkos sa HLA-A sa H2B-HLA-A-HMGA1 complex kumpara sa HLA-A nga nagbugkos sa H2B o HMGA1 lamang (Figure 8C, D; Table S5).Ang mga residu nga nalambigit sa hydrogen bonding (MD modeled high occupancy ≥ 10 ns) motakdo sa CLMS interaction sites (K or S residues) sa complex, nga nagsugyot nga ang mga interaksyon nga giila sa CLMS kasaligan kaayo.Kasaligan (Fig. 8E).Sa CLMS ug MD modeling, ang HLA-A residues tali sa mga 190-210 ug mga 200-220 amino acids nakit-an nga nagbugkos sa H2B ug HMGA1, matag usa (FIG. 8E).
Ang mga interaksyon sa protina-protina nagporma ug dinamikong istruktura nga mga network nga nagpataliwala sa intracellular nga komunikasyon agig tubag sa piho nga stimuli.Tungod kay daghang mga pamaagi sa proteomics ang nakamatikod sa mga pagbag-o sa kinatibuk-an nga makanunayon nga lebel sa estado sa usa ka protina, ang dinamikong interaksyon sa protina-protein nanginahanglan dugang nga mga himan aron makuha ang mga nagbugkos nga mga interface, ug ang CLMS usa sa ingon nga himan.Ang interferon signaling system kay usa ka cytokine network nga nagtugot sa mga selula sa pagtubag sa nagkalain-laing environmental pathogenic ug intrinsic pathological signals, nga mosangko sa induction sa mga subset sa interferon-inducible nga mga protina.Gi-apply namon ang CLMS aron mahibal-an kung ang mga interaksyon sa nobela nga protina-protein mahimong mailhan taliwala sa usa ka panel sa mga protina nga gipahinabo sa interferon.Ang global protein cross-linking analysis sa usa ka interferon-responsive nga Flo-1 cell nga modelo gigamit aron makuha ang mga complex sa protina.Ang pagkuha sa tryptic peptides gikan sa non-cross-linked ug cross-linked nga mga selula nagtugot sa peptide counting, pathway enrichment, ug peptide length distribution nga adunay gipiho nga LFQ intensity.Ang mga canonical interferon-inducible nga mga protina giila nga usa ka positibo nga internal nga kontrol, samtang ang bag-ong intermolecular ug intramolecular nga cross-linked nga mga adduct sa canonical interferon-inducible nga mga protina sama sa MX1, UP18, OAS3 ug STAT1 naobserbahan.Ang lainlaing mga bahin sa istruktura ug mga interaksyon sa mga lugar nga magamit ang gisusi.
Ang interaksyon tali sa HLA-A, MDN1 ug H2B nakit-an pinaagi sa immunoblotting sa Flo-1 ug A549 nga mga selula nga gitambalan ug wala matambalan sa IFNα.Gipasiugda sa among mga resulta nga ang HLA-A complex nga adunay H2B sa paagi nga nagsalig sa IFNα.Ang among trabaho nagrepresentar sa usa ka makapaikag nga agianan alang sa dugang nga pagsuhid sa co-localization niining duha ka mga complex.Makapainteres usab ang pagpalapad sa pamaagi sa CLMS sa usa ka panel sa mga linya sa cell aron mahibal-an ang mga interferon nga interferon-mediated nga interaksyon sa protina sa cell-type.Sa katapusan, gigamit namo ang MD modeling isip alternatibong pamaagi aron masabtan ang conformational dynamics sa mga protina nga nalambigit sa H2BFS-HLA-A-HMGA1 complex, nga nagsubay sa intramolecular ug intermolecular cross-talks.Ang mga inferens gikan sa datos sa CLMS nagsugyot sa posibilidad sa lainlaing mga konpormasyon sa H2BFS, HLA-A, ug HMGA1 nga mga protina.Ang posible nga lain-laing mga conformation tali niining mga docking protein complex nagpadayag sa daghang mga interaksyon nga susama sa naobserbahan sa CLMS dataset.Usa sa mga nag-unang kalig-on sa among pamaagi mao nga kini nagtugot sa dali nga pag-ila sa mga interaksyon nga mga polymorphic nga mga gene sama sa HLA, mao nga kini makapaikag nga tun-an ang mga interaksyon sa HLA haplotype-specific nga mga protina nga kung dili lisud tun-an.Gihiusa, gipakita sa among datos nga ang CLMS mahimong magamit aron mapalapad ang among pagsabut sa mga network sa pagsenyas nga gipahinabo sa interferon ug maghatag usa ka sukaranan sa pagtuon sa labi ka komplikado nga mga intercellular system sa tumor microenvironment.
Ang Flo-1 nga mga selula nakuha gikan sa ATCC ug gimentinar sa DMEM (Gibco) nga gidugangan sa 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% fetal bovine serum (Gibco) ug gitipigan sa 37°C ug 5% CO2.Paglumlum.Ang mga selula gipatubo ngadto sa 70-80% nga panagtagbo sa wala pa pagtratar sa IFNα14 (gigama sa Edinburgh Protein Production Facility).Ang tanan nga ubang mga kemikal ug reagents gipalit gikan sa Sigma Aldrich gawas kung gipahibalo.
Ang Flo-1 nga mga selula gi-kultura sa 6-well plate ug sa sunod nga adlaw ang mga selula gitambalan sa 10 ng / ml IFNα14 sulod sa 24 ka oras ngadto sa gibana-bana nga 80% nga panagtagbo.Ang mga selula gihugasan sa tulo ka beses sa PBS ug gi-ligated sa bag-ong giandam nga DSS (Thermo Fisher Scientific) (dissolved sa DMSO) sa PBS sulod sa 5 min sa 37 ° C. ngadto sa katapusang konsentrasyon sa 0.5 mM.Ang reaksyon sa crosslinking sa DSS gipulihan sa PBS ug ang nahabilin nga DSS gipalong pinaagi sa pagdugang 20 mM Tris (pH 8.0) sa PBS sa 15 min sa 37 ° C.Ang mga selyula gikolekta pinaagi sa pag-scrape ug gikolekta sa mga low binding tubes (Axygen).
Ang cell pellet gi-lysed sa 300 µl nga urea lysis buffer (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) sulod sa 30 min sa temperatura sa kwarto nga adunay panagsa nga pag-uyog.Ang tanan nga mga lakang sa centrifugation gihimo sa 14,000 xg sa 8 ° C.I-centrifuge ang lysate sulod sa 10 minutos ug ibalhin ang supernatant ngadto sa bag-ong tubo.Ang nahabilin nga tin-aw nga mga partikulo natunaw sa 150 μl sa ikaduha nga lysis buffer (2 M urea, 2% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) sa 30 minuto o labaw pa hangtod makuha ang homogenous aqueous solution.Ang lysate gi-centrifuged sulod sa 20 minutos ug ang supernatant gisagol sa lysate nga nakuha sa miaging lakang.Ang mga konsentrasyon sa protina gisusi gamit ang Micro BCA assay (Thermo Fisher Scientific) sumala sa mga instruksyon sa tiggama alang sa mga pamaagi sa microplate.Ang mga sample dali nga nagyelo sa liquid nitrogen ug gitipigan sa -80 °C.
Gibana-bana nga 100 μg sa matunaw nga cross-linked nga protina ang giproseso gamit ang usa ka giusab nga filtration sample preparation protocol (FASP) nga gihulagway ni Wisniewski et al.69 Sa mubo, ang protina gi-crosslink sa 200 µl nga urea buffer (8 M urea sa 0.1 M Tris, pH 8.5), gi-vortex ug gitunga.Ang tanan nga mga lakang sa centrifugation gihimo sa 14,000 xg sa 25 ° C.Ang unang katunga sa cross-linked protein lysate gibalhin ngadto sa usa ka 10 kDa Microcon centrifugal filter device nga nasangkapan sa Ultracel-10 membrane (Merck), gisundan sa centrifugation sa filter sulod sa 25 minutos.Dayon idugang ang ikaduha nga katunga sa protina sa filter ug balika ang sama nga mga lakang.Ang pagbawi sa protina gihimo pinaagi sa pagdugang sa 100 μl sa 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) sa urea buffer.Ang pagbawi gipalihok sa usa ka thermomixer sa 600 rpm sa 30 min sa 37 ° C.Dugang pa, ang kolum gi-centrifuged ug ang pagkunhod sa cross-linked nga protina gi-alkylated gamit ang 100 μl sa 50 mM iodoacetamide sa urea buffer.Ang reaksyon sa alkylation gihimo sa temperatura sa kwarto sulod sa 20 ka minuto sa kangitngit.I-rotate ang kolum, hugasi ang mga dingding sa kolum 3 beses gamit ang 100 µl urea buffer, ug dayon centrifuge.Ang parehas nga operasyon gihimo 3 ka beses gamit ang 100 μl nga 100 mM ammonium bicarbonate.Sa wala pa ang trypsinization, pulihan ang tubo sa koleksyon sa usa ka bag-o.Idugang ang digestion buffer nga adunay 50 mM ammonium bicarbonate ug 1 µl trypsin nga lasaw sa trypsin buffer (Promega).Ang ratio sa trypsin ngadto sa protina gimentinar sa mga 1:33, ug ang mga reaksiyon sa paghilis gilumlom sa tibuok gabii sa 37° C. sa humid nga lawak.Ang crosslinked peptide gikuha gikan sa filter pinaagi sa centrifugation sulod sa 25 minutos.Ang pagbawi sa peptide gipauswag pinaagi sa pagdugang sa 50 μl sa 0.5 M NaCl sa filter, gisundan sa centrifugation sa 25 minuto.
Ang C18 Micro Spin columns (Harvard Apparatus) gigamit sa pag-dessalt sa cross-linked tryptic peptides nga nagsunod sa protocol nga gihulagway ni Bouchal et al.70 nga adunay ginagmay nga mga kausaban.Sa mubo, ang C18 spin columns gi-activate sa tulo ka paghugas sa 0.1% formic acid (FA) sa acetonitrile (AcN) (Merck) ug duha ka paghugas sa 0.1% FA.Ang kolum gi-hydrated sa 0.1% FA sa 15 minuto.Ikarga ang mga sample sa spin column ug hugasi 3 beses gamit ang 0.1% FA.Ang mga desalted peptides sunod-sunod nga gi-eluted sa usa ka stepwise gradient gamit ang 50%, 80% ug 100% AcN sa 0.1% FA.Ang mga sample gipauga sa usa ka SpeedVac Plus concentrator (Eppendorf) hangtod nga ang nahabilin nga likido hingpit nga nawala.Ang eluted peptides natunaw sa 100 μl sa 0.08% trifluoroacetic acid sa 2.5% AcN ug ang mga konsentrasyon gisukod sa usa ka NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Gibana-bana nga 1 μg sa crosslinked peptide kada sample ang gi-inject sa LC-MS/MS system.
Ang cross-linked peptides gibulag sa usa ka UltiMate 3000 RSLCnano LC system (Thermo Scientific) nga konektado sa usa ka Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).Ang cross-linked peptides nakolekta sa 300 µm ID, 5 mm ang gitas-on nga µ-pre-column C18 capture column nga puno sa C18 PepMap100 sorbent ug 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).I-load ang pump flow set sa 5 µl/min 0.08% trifluoroacetic acid nga natunaw sa 2.5% AcN.Ang cross-linked peptides gibulag sa usa ka analytical fused silica column nga adunay inner diameter nga 75 μm ug usa ka gitas-on nga 150 mm, nga puno sa usa ka 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Ang mga mobile phase A ug B naglangkob sa 0.1% FA sa tubig ug 0.1% FA sa acetonitrile, matag usa.Ang gradient magsugod sa 2.5% B ug motaas sa linearly ngadto sa 40% B sulod sa 90 minutos, dayon ngadto sa 90% B sa sunod nga 2 minutos.Ang komposisyon sa mobile phase gipadayon sa 90% B sulod sa 10 minuto ug dayon mikunhod sa linearly sa 2.5% B sa 2 minuto.Ang kolum gibalanse sa 2.5% B sulod sa 8 minutos sa wala pa ang sunod nga siklo.Ang cross-linked peptides nga gipagawas gikan sa analytical column gi-ionized sa usa ka nanoelectrospray ionization (NSI) source ug gi-injected ngadto sa Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).
Ang Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer naglihok sa positibo nga data correlation mode.Ang usa ka bug-os nga scan gihimo sa seksyon mode sa usa ka resolusyon sa 120,000 uban sa range setting gikan sa m/z 350 Th ngadto sa m/z 2000 Th.Ang normal nga target sa AGC gitakda sa 300% nga adunay labing taas nga oras sa pag-input nga 50ms.Ang monoisotopic peak detection natukod alang sa mga peptide.Ang parametro sa pagpahayahay sa pagpugong gitakda sa tinuod kung gamay ra kaayo nga mga precursor ang makit-an.Ang minimum nga kalig-on sa ionic sa pasiuna gitakda sa 5.0e3 ug ang nag-una nga bayad nag-ingon hangtod sa +8 gilakip sa mga eksperimento.
Ang cycle time tali sa major scans sa data correlation mode gitakda sa 2.5 seconds.Ang dinamikong mass exclusion gitakda sa 20 s human sa unang fragmentation sa precursor ion.Ang precursor isolation window gitakda sa 2 Th.Ang matang sa normalized collision energy nga adunay fixed collision energy mode gipili sa data dependent MS/MS scan.Ang kusog sa pagbangga gitakda sa 30%.Ang resolusyon sa Orbitrap gitakda sa 15,000 ug ang target sa AGC sa 100%.Ang naandan nga maximum nga oras sa pag-injection gitakda sa 60 milliseconds.
Sa wala pa masubay ang network sa protina-protein sa mga cross-linked nga mga sample, giproseso namon ang hilaw nga mga file gamit ang MaxQuant package (bersyon 1.6.12.0)26,27 aron mahibal-an ang masubay nga mga peptide / protina sa mga sample.Dugang pa, ang susama nga pag-analisa sa proteomic gihimo sa wala ma-crosslink nga mga sampol sa Flo-1 nga gitambalan ug wala matambalan sa IFNα.Ang datos sa MS/MS gipangita sa UniProt human database (www.uniprot.org) (gi-upload niadtong Agosto 12, 2020, adunay 75,093 ka entries) gamit ang built-in nga search engine nga Andromeda27.Ang pagpangita gihimo nga wala magpakita sa espesipiko sa enzyme ug lain-laing mga kausaban sa deamidation (N, Q) ug oxidation (M).Ang precursor mass tolerances gitakda sa 20 ppm ug mga ion sa produkto sa 0.02 Da.Ang inisyal ug maximum nga mass deviation gitakda sa 10 ppm.Ang kinatas-ang masa sa peptide gibutang sa 4600 Da ug ang pagkaparehas sa han-ay gitakda tali sa 7 ug 25 amino acids (aa).Ang dugang nga statistical analysis gihimo gamit ang Perseus program (bersyon 1.6.10.45).Ang sulod sa protina gikalkulo pinaagi sa pag-normalize sa spectral intensity sa protina (LFQ intensity; unlabeled quantification)27 ug ang intensity values ​​nakabig ngadto sa Log2.Ang usa ka hierarchical clustering sa mga protina nga giila sa ilang peptide intensity gitukod gamit ang pheatmap (v1.0.12) nga pakete sa R ​​(v 4.1.2).Ang pag-analisa sa pagpaayo sa agianan gihimo gamit ang database sa Reactome pathway alang sa mga protina nga gitambalan sa IFNα nga sobra sa upat ka beses nga gi-aktibo kumpara sa wala matambalan nga mga sample.
Ang pag-ila sa lysine (K) o serine (S) nga piho nga kemikal nga mga crosslink sa mga complex sa protina nga gimonitor sa LC-MS / MS gihimo gamit ang spectroscopic identification machine (SIM-XL) alang sa cross-linked peptides (SIM-XL)29.Una, ang posibleng interaksyon tali sa interferon-associated (IFN) DNA damage resistance signature (IRDS) genes giimbestigar gamit ang IRDS protein dataset nga gihulagway sa Padariya et al.28.Ang pag-screen sa tanang kondisyon ug pagsubli sa tibuok tawo nga UniProt kay computationally intensive, mao nga ang tibuok database sa UniProt sa tawo (www.uniprot.org) (na-download 12 August 2020, adunay 75,093 entries) batok sa IFNα-treated repeats.Usa sa mga filter alang sa taas nga pagsalig nga mga interaksyon.Kining taas nga kahulogan nga mga interaksyon nga nakuha gipalapdan ug gisulayan sa tanan nga mga pagbalik-balik ug mga kondisyon.
Sa SIM-XL, ang DSS gigamit alang sa crosslinker (XL) ug ang XL weight shift ug modification weight shift gitakda sa 138.06 ug 156.07, matag usa.Ang mosunod nga crosslinking reaction sites gikonsiderar: KK, KS ug KN-TERM, walay reporter ions.Ang precursor ug fragment ppm gibutang sa 20 ug ang Xrea threshold gitakda sa 0.15.Ang Trypsin giisip nga bug-os nga espesipiko, ug usa ka high-energy C-trap (HCD) fragmentation method ang gipatuman.Ang XCorr dinamikong DB reduction threshold ug ang minimum nga gidaghanon sa mga peptide alang sa dinamikong DB reduction gitakda sa 2.5 ug 2, matag usa.Ang ubang mga parametro mao ang: monoisotope probability ug peak coincidence cutoff, minimum 4 AA residues kada strand ug maximum strand charge, ug 3 maxima sa missed splits.Ang resulta nga stitched 2D nga mga mapa gisusi sa (SIM-XL) ug ang xQuest28 graphical nga representasyon gigamit sa paghimo sa 2D nga mga mapa.Ang mga crosslink sa protina sa mga istruktura sa protina gihatag sa PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, bersyon 2.0 Schrödinger, LLC).
Ang mga istruktura sa modelo sa protina gimugna gamit ang Phyre2 server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 gamit ang mga prinsipyo sa homology modeling ug pagpatuman sa "Hidden Markov Method".Ang Phyre2 nagmugna og mga istruktura sa modelo base sa pagkasunod-sunod nga pag-align sa nahibal-an nga mga istruktura sa protina.Para sa H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, ug MDN1 nga mga protina, gigamit ang template structures 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, ug 6i2665.Dugang pa, ang istruktura sa AlphaFold71 MX1, UBP18 ug ROBO1 gikonsiderar usab.Ang istruktura sa protina gihulagway gamit ang BIOVIA Discovery Studio Visualizer package (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) ug ang Molecular Operating Environment package (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).